细菌基因组测序常见问题
关键词：细菌基因组测序；Roche 454测序平台；HiSeq 2000测序平台 1. Roche 454测序平台和HiSeq 2000测序平台在细菌基因组测序
关键词：细菌基因组测序；Roche 454测序平台；HiSeq 2000测序平台 1. Roche 454测序平台和HiSeq 2000测序平台在细菌基因组测序中有哪些区别？
| Roche 454测序平台 | HiSeq 2000测序平台 | |
| 测序读长 | 300～700bp | 100bp |
| 对样品要求 | 2μg | 5μg |
| 多样本平行测序 | 可以 | 可以 |
| 测序覆盖率 | 20× | 100× |
| 优点对比 | 读长长，拼接结果更准确，单一读长的准确性超过99.5%，但错误有固定模式。从精细图到完成图，Gap Closing成功率高。 | 通量高，价格低，碱基错误率为1 %，且错误有明显倾向。 |
| 缺点对比 | 连续单碱基重复区容易发生碱基移码错误 | 读长短，不利于拼接，从精细图到完成图，Gap Closing成功率低 |
| 总费用 | 高 | 低 |
2. 对于GC含量过高或过低的基因组，能否通过测序达到相应组装标准？
当GC含量大于65%或者小于35%时，测序和组装难度均增加，可以使用454进行长序列测序，再使用HiSeq 2000进行MP测序，以最大程度的获得序列信息。
3. 重复序列是否影响数据拼接？
重复序列会对数据拼接造成一定影响。通过构建不同梯度的MP文库并进行HiSeq 2000测序，可以对重复序列引起的错拼进行校正。当前的拼接软件所采用的算法在一定程度上也会减少重复序列造成的错拼。
4. 细菌基因组测序的最佳策略是什么？
基于大量的测序经验及对各种测序方法优劣势的充分理解，目前认为ABI3730xl + Roche 454 + HiSeq 2000全基因组测序三合一是最优解决方案，使1+1+1>3成为可能。
Roche 454的长序列de novo拼接效果极佳，而HiSeq 2000 MP测序则能进一步组装454的拼接结果，获得更长具有明确顺序信息的序列。两种测序方法优势互补，大大减少了基因组上因特异结构造成的无法测序区的数量。两种测序方法相互印证，所有位点均由两种完全不同的测序方法得到，解决了单一测序方法SNP正确性无法验证的弊端。
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