利用PCR分析酵母菌落

Taq DNA 聚合酶 寡核苷酸引物 DNA 标准参照物 YAC 重组子的酵母菌株
PCR 缓冲液 dNTP 溶液
琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶 微量离心管 程控式 PCR 仪

一、材料

1. 缓冲液和溶液

10X 菌落 PCR 缓冲液

dNTP 溶液（10 mmol/L), 含有 4 种 dNTP ( pH 8.0，PCR 级）

MgCl2 ( 25 mmol/L)

2. 酶及其缓冲液

Taq DNA 聚合酶

3. 凝胶

琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶

4. 核酸和寡核苷酸

寡核苷酸引物

DNA 标准参照物

5. 专用设备

微量离心管（0.5 ml)

储存有所需 PCR 方案的程控式 PCR 仪

6. 载体和酵母菌株

携带有目的 YAC 重组子的酵母菌株

二、方法

1. 在一个无菌的 0.5 ml 微量离心管里，依次序加入下列物质：10X 菌落 PCR 缓冲液 2 ul，25 mmol/L MgCl2 1.2 ul，10 mmol/L dNTPs 0.4 ul，寡核苷酸引物 每个引物浓度为 10 pmol，Taq 聚合酶 5 单位（0.2 ul），H2O 加至总体系为 20 ul。

2. 用一个黄色的一次性移液器吸头，吸取少量酵母菌落 ( 0.10~0.25 ul )，加入反应体系。

3. 将 PCR 管放进 PCR 仪内。按下面程序进行 PCR 反应。



4. 用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 PCR 产物。电泳应采用适宜大小的标准参照物。

1.  设计引物很关键。一般如果是定向克隆，用载体上的通用引物即可。如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳，同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。

2.  使用的引物浓度不能太高，浓度过高会导致非特异性扩增，反应的循环数也不能太多，一般不超过25个。同时因为扩增的片段的GC含量问题，有的GC含量很低，有的又很高，导致菌落PCR不容易扩增出目的条带，在此建议在设置PCR程序时以高GC的温度为上限，每一循环降0.2度左右。