分子实验方法10: 测序技术

在分子生物学研究中，DNA 的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。

这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA 序列。目前Sanger测序法得到了广泛的应用。

Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA 聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。

由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。

它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

第一节 非同位素银染测序系统操作技术

一、概述：

Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA 测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。 银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到；电泳完成后经90分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。

此外，SILVER SEQUENCETM系统用未修饰的5'OH寡聚核苷酸作为引物， 减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作，也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外，也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。

Taq DNA 聚合酶在95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA 聚合酶是一种Taq DNA 聚合酶的修饰产品，对于双链DNA 模板有非常好的效果，具有高度的准确性，能产生均一的条带，且背景低。

SILVER SEQUENCETM系统包含被修饰的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。

退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR产物(<500bp)得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。

在较低温度时，聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域，它可导致聚合酶解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因，应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用95℃变性、70℃退火/延伸的循环模式。

一般来说，较长的引物及GC含量高的引物能得到较强的信号。实验结果表明，>24mer的GC含量约为50%的引物可得到最佳结果。

由于本系统采用热循环装置，与常规的测序方法相比具有如下几点好处：

(1).本方法线性扩增模板DNA 产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带，测序反应需要0.03--2pmol模板DNA ，随模板种类而定。

(2). 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA (dsDNA )模板的碱变性及乙醇沉淀过程，变性循环也有助于消除由于线性dsDNA 模板(如PCR反应产物)快速重退火所引起的问题。

(3). 高温聚合酶反应减弱了DNA 模板的二级结构，允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。

二、材料

待测已提纯的DNA ，可为单链，也可为双链。

三、设备

高压电泳仪，测序用电泳槽，制胶设备，PCR仪。

四、试剂

（1）SILVER SEQUENCETM DNA 测序试剂盒。

（2）丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液（38%丙烯酰胺 W/V，2%甲叉双丙烯酰胺 W/V)：95g丙烯酰胺，5g甲叉双丙烯酰胺溶于140ml 双蒸水中，定容至250ml，0.45mm过滤器过滤后，贮于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2周。

（3）10%过硫酸铵，0.5g过硫酸铵溶于4ml水中，定容至5ml，应新配新用。

（4）10×TBE缓冲液（1 mol/L Tris，0.83mol/L 硼酸，10mmol/L EDTA)： 121.1g Tris，51.35g硼酸，3.72g Na2 EDTA ・2H2O，溶于双蒸水中定容至1升，置于4℃下可贮存2周，其pH约为8.3。

（5）TBE电极缓冲液：10×TBE 缓冲液稀释至1×TBE备用。

（6）TEMED

（7）固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配制2升备用。

（8）染色溶液：硝酸银2克，甲醛3ml，溶于2升超纯水中备用。

（9）显影溶液：60克碳酸钠（Na2CO3)溶于2升超纯水中，使用前加3ml 37% 甲醛和 40ml硫代硫酸钠溶液（10mg/ml)。

（10）95%乙醇。

（11）0.5%冰乙酸。

（12）Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。