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DNA实验

细菌总DNA的提取和鉴定

2024-10-11 DNA实验 加入收藏
【目的和要求】1.学会CTAB法提取细菌总DNA。2.掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳法。【实验原理】DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的,因此提取出脱氧

【目的和要求】

1.学会CTAB法提取细菌总DNA。

2.掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳法。

【实验原理】

DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的,因此提取出脱氧核糖核蛋白复合物后,必须将其中蛋白质去除。CTAB(溴代十六烷基三甲胺)是一种去污剂,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中可溶并且稳定存在,若降低盐浓度,CTAB与核酸的复合物会沉淀出来,而大部分蛋白和多糖仍溶于溶液中。

DNA的电泳原理与蛋白质的电泳原理基本相同。DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于DNA分子或DNA片断的分子量差别,电泳后呈现迁移位置的差异。

【实验试剂和器材】

(一)试剂:

菌株(E.coli );蛋白酶K(20mg/ml);琼脂糖;标准DNA水解液

1.10%SDS

2.酚/氯仿/异戊醇(1/1/1)

3.异丙醇;70%乙醇

4.LB培养基:蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl 10g加蒸馏水至1升,然后灭菌备用。

5.TE缓冲液:10mM Tris• HCl,0.1mM EDTA (pH8.0)。

6. CTAB/NaCl溶液(5% w/v):5g CTAB 溶于100ml 0.5M NaCl溶液中,需要加热到65℃使之溶解,然后室温保存。

7.TAE缓冲液(50×)(pH8.0):每升溶液中含有242g Tris,57.1ml 冰乙酸,100ml 0.5mol/L EDTA。电泳时稀释成1× 浓度使用。

8.溴酚兰-甘油指示剂:先配制0.1%溴酚兰水溶液,然后取1份0.1%溴酚兰溶液与等体积的甘油混合即成

9.0.5μg/ml 溴乙啶染液:称取5mg溴乙啶,用重蒸水溶解定容到10ml,取1ml此溶液用1xTAE缓冲液稀释到1升,最终浓度为0.5μg/ml。

(二)器材:

锥形瓶(250ml),1.5ml 离心管,水浴锅,离心机,电泳槽,电泳仪,摇床,移液枪,洁净工作台,电磁炉,紫外成像仪

【实验方法】

(一)细菌总DNA的提取

1.将菌株接种于液体LB培养基,37℃震荡培养过夜。

2.取1.5ml培养物12000rpm离心2min。

3.沉淀物加入567μl的TE缓冲液,反复吹打使之重新悬浮,加入30μl 10%SDS和15μl的蛋白酶K,混匀,于37℃温育1h.

4.加入100μl 5mol/L NaCl,充分混匀,再加入80μl CTAB/NaCl溶液,混匀后再65℃温育10min。

5.加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀,离心4-5min,将上清转入一只新管中,加入0.6-0.8倍体积的异丙醇,轻轻混合直到DNA沉淀下来,沉淀可稍加离心。

6.沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后,离心弃乙醇,在洁净工作台中稍加干燥,重溶于20μl TE缓冲液(含RNaseA-25ng/ml)中,准备电泳检测。

(二)琼脂糖凝胶电泳

1.制胶:称取琼脂糖粉末,置于三角瓶中,加入TAE缓冲液配成0.8%的浓度,加热使琼脂糖全部融化于缓冲液中,待溶液温度降至65℃时,立即倒入制胶槽中,插入样品梳。在室温放置0.5-1h,待凝胶全部凝结后,轻轻拔出样品梳。然后在电泳槽中加入电泳缓冲液直到没过凝胶为止。

2.加样:取0.5-1μg 左右的样品,体积为10-20μl,加入1/4体积的溴酚兰-甘油指示剂,混匀后小心地加到样品槽中。同时另取一个已知分子量的标准DNA水解液,在同一凝胶板上进行电泳。

3.电泳:维持恒压100V,电泳0.5-1h,直到溴酚兰指示剂移动到凝胶底部,停止电泳。

4.染色:

将凝胶取出后浸入0.5mg/ml 溴乙啶溶液中,染色0.5-1h。染液可反复多次使用。

5.观察:

将凝胶板置于254nm波长紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现橙黄色荧光。

【注意事项】

1.溴乙啶有毒,配制和使用溶液时要戴手套,勿将溶液滴洒在台面或地面上。溴乙啶溶液于室温保存在棕色瓶中。

2.倒凝胶板时不要太厚,否则影响电泳效果。


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