质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测

一、碱变性法提取质粒DNA

质粒(Plasmid)是细菌染色体外能自身独立复制的双股环状DNA。带有遗传信息，可赋予细菌某些新的表型。将质粒指纹图谱分析方法、质粒DNA探针技术及检测质粒的PCR技术用于临床感染性疾病的诊断和流行病学调查已成为现实。质粒作为载体在基因工程中起着重要的作用。

分离和纯化质粒DNA的方法很多，但这些方法基本包括三个步骤：即细菌的培养和质粒DNA的扩增，细菌菌体的裂解；质粒DNA的提取与纯化。

本实验学习用碱变性方法提取质粒DNA。

原理

细菌培养物加入SDS和NaOH碱性溶液处理后，菌体裂解，可使细菌的质粒DNA、染色体DNA和RNA一起从细胞内释放出来，经琼脂糖凝胶电泳，因各种核酸分子的迁移率不同将上述核酸分成不同的带。用溴化乙锭（EB）染色后，在紫外线灯下可看到各种核酸带发出的荧光。根据荧光的位置，可区分不同的核酸带。

材料

1．菌株E.coliJM109（pUC19），E.coliRRI（pBR322）

2．试剂溶液Ⅰ(50mM葡萄糖，25mMTris.HclPH8.0，10mMEDTA)

溶液II(0.2NNaOH，1%SDS)用前新配制

溶液III(5mMKAc溶液PH4.8)

TE缓冲液(10mMTris.HCl，1mMEDTAPH8.0)

LB液体培养基(胰蛋白胨10g，酵母粉5g，Nacl10g。加蒸馏水溶解，用NaOH调PH至7.5，加水至1000ml，15磅高压灭菌15分钟)。

方法

1．接种细菌于5mlLB液体培养基中，37℃培养过夜。

2．3000rpm/min，离心15min，弃上清。加入100ul溶液Ⅰ悬起细菌沉淀。

3．加入200ul前新配制的溶液II，颠倒EP管5次混合均匀，置冰浴2min。

4．加入150ul溶液III温和地混匀，12000rpm/min,离心5min。

5．吸取上清清亮裂解液放入另一新EP管中，加等体积酚-氯仿-异戊醇抽提2次，12000rpm/min，离心2min。（若不做酶切，此步可省略）吸取上清放入另一新EP管中，加入二倍体积的冷乙醇，12000rpm/min，离心10min。

6．弃乙醇，干燥后用30ulTE缓冲液洗下核酸，待电泳检测。

二、琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳技术（Agarosegelelectroghoresis）是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。凝胶分辨率决定于使用材料的浓度，并由此决定凝胶的孔径。琼脂糖凝胶可分辩0.1~6.0kb的双链DNA片段。琼脂糖凝胶电泳是一个电场作用。它首先利用琼脂糖的分子筛效应，此外，在弱碱性条件下，DNA分子带负电荷，从负极向正极移动。根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同，它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。借助溴化乙锭（EB）能与双链DNA结合的作用，利用EB染色，并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。

材料

1．琼脂糖、10×TAE电泳缓冲液（40mMTris，20mMNaAc，1mMEDTAPH8.0）

2．载体缓冲液（0.25%溴酚蓝，30%甘油）、溴化乙锭水溶液（10mg/ml）

3．凝胶槽、电泳仪

方法

1．取琼脂糖0.9g，加入100ml1xTAE电泳缓冲液于250ml烧瓶中，100℃加热溶解。

2．平衡凝胶槽，放好两侧挡板，调节好梳子与底板的距离（一般高出底板0.5~1mm）。

3．铺板：在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5ug/ml的溴化乙锭水溶液，轻轻混匀，待冷至50℃左右倒入凝胶槽，胶厚一般为5~8mm。

4．待胶彻底凝固后，去掉两侧挡板，将凝胶放入盛有电泳液的槽中（加样孔朝向负极端，DNA由负极向正极移动），使液面高出凝胶2~3mm，小心拔出梳子。

5．DNA样品与载体缓冲液5：1混合并加入凹孔中（样品不可溢出）。

6．打开电源，调节所需电压，电压与凝胶的长度有关，一般使用电压不超过5v/cm。

7．据指示染料移动的位置，确定电泳是否终止（溴酚蓝的涌动距离在5sRNA和0.3kbDNA带之间）。

8．电泳完毕关闭电源。将凝胶放紫外灯下观察并拍照。