碱裂解法提取质粒DNA的研究

质粒是存在于细菌染色体外的一个或多个能独立复制并稳定遗传的小型环状双链DNA分子，其分子量一般在0. 2～10kD 范围内。由于质粒分子小，便于分离和提取，可以携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达。基因克隆实验中常将经改造后的质粒作为运送基因的载体，质粒D2NA提取效率及质量对后续实验步骤(如酶切、连接、转化大肠杆菌与PCR扩增等)的成功与否有着直接的关系，因而高效快速地从细菌细胞中分离纯化质粒具有重要意义[ 1 ] 。目前从细菌中提取质粒DNA多采用碱裂解法，该法操作简便，但若明确其中主要试剂的作用，所提取的质粒DNA 的纯度及质量会更高。笔者通过不同的试剂进行摸索，现将结果报告如下。

1　材料和方法

1. 1　材料

1. 1. 1　实验菌株　使用菌株为大肠杆菌DH5α，菌株内含质粒pB I121，该质粒上克隆一h IL212基因。

1. 1. 2　主要试剂　氨苄青霉素、RNaseA购自华美生物工程公司; DL15000、DL2000核酸分子量标记购自TAKARA公司;其它各种常规化学试剂均为分析纯。

1. 2　方法

1. 2. 1　质粒DNA的提取[ 1 ] 　采用4种不同的方法进行质粒DNA的提取，所用具体试剂见表1:

①挑取单菌落，接种于4. 0mlLB (含氨苄青霉素)液体培养基中， 37℃、250 rpm振荡培养过夜(约12～14h) 。

②取1. 5ml培养物加入Eppendorf管中，室温12000g离心1min，弃上清。

③将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。

④加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀(不要剧烈振荡) ，并将离心管放置于冰上2min。

⑤加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀冰上放置3min。

⑥加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀， 4℃离心。12000g ×10min。

⑦小心移出上清于一新Eppendorf管中，加入2 /3倍体积异丙醇，混匀， 4℃离心12000g×5min。

⑧1. 0ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1 ～2次，沉淀在室温下晾干。

⑨沉淀溶于50μlTE (含RNaseA 20μg/ml) ， 37℃水浴30min 以降解RNA 分子， - 20℃保存备用。

1. 2. 2 　质粒DNA 的定量及杂质检测　各取样品10μl释稀200 倍后，分别测定OD260 和OD280 值，若OD260 /OD280 > 2. 0，表明DNA 中含有RNA杂质。若OD260 /OD280 < 1. 6，表明样品中含有酚或蛋白质。

1. 2. 3　质粒DNA单酶切后的电泳检测[ 2 ] 　分别取四种方法得到的质粒DNA 1μl，进行酶切。反应体系为20μl，在0. 5ml Eppendorf管中依次加入ddH2O，10 ×酶切反应缓冲液， BSA， 1μg质粒DNA，限制性内切酶Sma Ⅰ0. 5μl， 于37℃酶切2h， 加适当loadingbuffer混匀上样， 在0. 8%琼脂糖凝胶上电泳，采用5V / cm的电压，电泳3h， EB染色，取出凝胶置紫外灯下检测，拍照。

1. 2. 4　PCR扩增h IL - 12特异片段　引物为一对能够扩增1613bp的h IL - 12基因的特异性引物: ①上游引物5’- TCC CCC GGG CCA CCA TGG GTC ACCAGC A - 3’; ②下游引物5’- A CCG GAG CTC TTAGGA AGC ATT CAGATA G - 3’。分别取4种方法提取的质粒DNA为模板进行PCR扩增反应， PCR反应体系为20μl 混匀后在下列循环参数下进行扩增:94℃5 min， 72℃6 min。取4μl PCR扩增产物和1μl 溴酚兰上样缓冲液在1. 5%琼脂糖凝胶上电泳，电压4V / cm，电泳2h[ 3 ] 。

2　结果

2. 1　质粒DNA的定量及杂质检测　表2结果显示:是否使用溶液Ⅰ对实验基本上没有影响，溶液Ⅱ中的NaOH直接关系到所提取质粒DNA 的量，溶液Ⅲ中的醋酸钾主要是与SDS (十二烷基硫酸钠)作用生成PDS(十二烷基硫酸钾) ，从而使大部分蛋白质沉淀。

表2　不同方法提取的质粒DNA的吸光度