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DNA实验

大肠杆菌质粒DNA 的提取(碱裂解法)

2024-10-12 DNA实验 加入收藏
此方法适用于小量质粒DNA的提取提取的质粒 DNA可直接用于酶切PCR 扩增。1. 取 1.5ml 细菌培养物于 EP 管中,4000rpm 离心 1 分钟,弃

此方法适用于小量质粒DNA的提取提取的质粒 DNA可直接用于酶切PCR 扩增。

1. 取 1.5ml 细菌培养物于 EP 管中,4000rpm 离心 1 分钟,弃上清液,使细菌沉淀尽量干燥;

2. 将细菌沉淀重悬于用冰预冷的 100μl 溶液 I (50 mmol/L 葡萄糖,10 mmol/L EDTApH 8.0, 25 mmol/L Tris-HClpH 8.0) 中,剧烈振荡;

3. 加入 200μl 新配制的溶液 II(0.2 mol/L NaOH,1%SDS(m/v)) ,盖紧 EP 管口,快速颠倒离心管 5 次,以混合混合物,确保离心管的整个内表面与溶液 II 接触,不要涡旋,置于冰浴中;

4. 加入 150μl 预冷溶液 III(每 100 ml 的溶液 III 中含 60 ml 5 mol/L 乙酸钾, 11.5 ml 冰乙酸, 28.5 ml H2O),盖紧 EP 管口,反复颠倒数次,使溶液 III 在粘稠 的细菌裂解物中分散均匀,之后将管置于冰上 3~5 分钟;

5. 在最大转速下离心 5min,取上清液于另一新 EP 管;

6. 用两倍体积的乙醇室温沉淀双链 DNA,振荡混合于室温放置2 分钟,最大转 速离心 5 分钟;

7. 小心吸去上清液,将离心管倒置于滤纸上,以使所有液体都流出,在将附于管壁的液滴除尽;

8. 加 1ml 70%乙醇洗涤沉淀,振荡混合,用 12,000g 离心 2 分钟,弃上清,将 开口的 EP 管置于室温使乙醇挥发, 直至EP 管中内没有可见的液体存在 (5~ 10 分钟) ,用适量的ddH2O 溶解;

9. 用 0.5μl 的 RNase 37℃温育 5~10 分钟;

10. 电泳鉴定。


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