植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测

背景知识：

核酸的存在形式：脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体DNA(ctDNA)。

核酸的理化性质：DNA为白色类似石棉样的纤维状物， RNA的纯品呈白色粉末或结晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。

基本过程：

细胞破碎→抽提去蛋白质 →沉淀核酸

细胞破碎： 1. 机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法； 2. 化学试剂法：用SDS处理细胞； 3. 酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。

DNA提取： 1. SDS法 SDS是有效的阴离子去垢剂，细胞中DNA与蛋白质之间，常借静电引力或配位键结合，SDS能够破坏这种价键。 2. CTAB法 CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。

DNA纯化（去杂质）： 1. 蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。 2. RNA 常选用RNase消化，或是用LiCl来消除大分子的RNA。 3. 酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。 4. 多糖提取液中加1％PVP。

材料与试剂：

实验材料：新鲜蔬菜叶片(去叶脉)

试剂：2×CTAB抽提液；TE 缓冲液(pH=8.0)；氯仿：异戊醇(24:1)

仪器用具：①离心机；②水浴锅；③研钵；④微量移液器

操作步骤：

1. 取 2g 清洗凉干的新鲜叶片于研钵中，加1/3 药匙石英砂和 4mL 2 倍的 CTAB 提取液，迅速研磨。

2. 将 1mL 研磨液转入 1.5mL 离心管中，置于65℃水浴中保温 20min，其间颠倒混匀2－3次。破碎细胞

3. 12000r/min 离心 5min，取上清液700μL转到另一离心管中。加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）混合液，充分颠倒混匀。12000r/min，离心 5min。抽提去蛋白

4. 将上清液移入新的1.5mL离心管内，加600%26micro;L异丙醇。颠倒混匀，可见 DNA 絮状沉淀。沉淀核酸

5. 12000r/min，离心1min，倒掉上清液，将离心管倒置干燥。 将沉淀回溶于20%26mL TE 缓冲液待测。

注意事项：

1. 选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与 CTAB 抽提液充分混匀；

2. 若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇（2－5%），尽可能选取幼嫩的材料；

3. 收集 CTAB 与核酸形成的复合物时不要离心过度，否则沉淀再溶解难；

4. 为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。

电泳原理：

DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。

仪器和试剂：电泳仪；电泳槽；灌胶模具等

常用电泳缓冲液：Tris-硼酸（TBE）；Tris-乙酸（TAE）；Tris-磷酸（TPE）。 上样缓冲液：电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。作用：①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色，使加样操作更方便。

核酸染色剂：溴化乙锭（EB）：是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带。注意事项：EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。

操作步骤：

1. 凝胶制备 制备0.8%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加入 20mL 0.5×TBE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60℃ 时，加入 EB 至终浓度 0.5%26mg/mL。缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。

2. 加样 取10%26ml DNA样液与 2%26ml 上样 buffeer 混匀，用微量移液器小心加入样品槽。

3. 电泳 接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为1~5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算），待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。

4. 观察拍照