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DNA实验

植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测

2024-10-12 DNA实验 加入收藏
背景知识:核酸的存在形式:脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)与蛋白质结合在一起以核蛋白(DNP)的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白

背景知识:

核酸的存在形式:脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)与蛋白质结合在一起以核蛋白(DNP)的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存在于细胞核内,后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内,例如线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体DNA(ctDNA)。

核酸的理化性质:DNA为白色类似石棉样的纤维状物, RNA的纯品呈白色粉末或结晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物,一般都溶于水,不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂,它们的钠盐比游离酸易溶于水。在酸性溶液中,核酸易水解,中性或弱碱性溶液中较稳定。

基本过程:

细胞破碎→抽提去蛋白质 →沉淀核酸

细胞破碎: 1. 机械方法:超声波处理法、研磨法、匀浆法; 2. 化学试剂法:用SDS处理细胞; 3. 酶解法: 加入溶菌酶或蜗牛酶,破坏细胞壁。

DNA提取: 1. SDS法 SDS是有效的阴离子去垢剂,细胞中DNA与蛋白质之间,常借静电引力或配位键结合,SDS能够破坏这种价键。 2. CTAB法 CTAB是一种阳离子去垢剂,它可以溶解膜与脂膜,使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来,并使蛋白质变性,使DNA与蛋白质分离。

DNA纯化(去杂质): 1. 蛋白质 常用苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)或氯仿:异戊醇(24:1)抽提。 2. RNA 常选用RNase消化,或是用LiCl来消除大分子的RNA。 3. 酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇,选取幼嫩的材料。 4. 多糖提取液中加1%PVP。

材料与试剂:

实验材料:新鲜蔬菜叶片(去叶脉)

试剂:2×CTAB抽提液;TE 缓冲液(pH=8.0);氯仿:异戊醇(24:1)

仪器用具:①离心机;②水浴锅;③研钵;④微量移液器

操作步骤:

1. 取 2g 清洗凉干的新鲜叶片于研钵中,加1/3 药匙石英砂和 4mL 2 倍的 CTAB 提取液,迅速研磨。

2. 将 1mL 研磨液转入 1.5mL 离心管中,置于65℃水浴中保温 20min,其间颠倒混匀2-3次。破碎细胞

3. 12000r/min 离心 5min,取上清液700μL转到另一离心管中。加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)混合液,充分颠倒混匀。12000r/min,离心 5min。抽提去蛋白

4. 将上清液移入新的1.5mL离心管内,加600%26micro;L异丙醇。颠倒混匀,可见 DNA 絮状沉淀。沉淀核酸

5. 12000r/min,离心1min,倒掉上清液,将离心管倒置干燥。 将沉淀回溶于20%26mL TE 缓冲液待测。

注意事项:

1. 选取新鲜材料,研磨迅速彻底,研磨好的材料应与 CTAB 抽提液充分混匀;

2. 若提取产物有颜色,可能是材料中含有较多的多酚类物质,添加巯基乙醇(2-5%),尽可能选取幼嫩的材料;

3. 收集 CTAB 与核酸形成的复合物时不要离心过度,否则沉淀再溶解难;

4. 为了获得具有生物活性的天然核酸,在分离制备过程中必须采用温和的条件,避免过酸过碱、剧烈地搅拌,防止热变性,同时还要避免核酸降解酶类的降解。

电泳原理:

DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。在一定电场强度下,DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高,孔隙越小,其分辨能力就越强。

琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)
0.35~60
0.61~20
0.70.8~10
0.90.5~7
1.20.9~6
1.50.2~3
12.00.1~2

仪器和试剂:电泳仪;电泳槽;灌胶模具等

常用电泳缓冲液:Tris-硼酸(TBE);Tris-乙酸(TAE);Tris-磷酸(TPE)。 上样缓冲液:电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色,一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。作用:①增加样品比重,以确保DNA均匀沉入加样孔内。②形成肉眼可见的指示带,预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色,使加样操作更方便。

核酸染色剂:溴化乙锭(EB):是一种荧光染料,EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间,在紫外线激发下,发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。琼脂糖凝胶EB染色,肉眼可见核酸电泳带。注意事项:EB是致癌物质,切勿用手接触,更不要污染环境。

操作步骤:

1. 凝胶制备 制备0.8%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加入 20mL 0.5×TBE,加热至琼脂糖全部熔化,冷却至50-60℃ 时,加入 EB 至终浓度 0.5%26mg/mL。缓慢倒入胶板,待胶凝固后拔出梳子。

2. 加样 取10%26ml DNA样液与 2%26ml 上样 buffeer 混匀,用微量移液器小心加入样品槽。

3. 电泳 接通电源,切记靠近加样孔的一端为负,电压为1~5V/cm(长度以两个电极之间的距离计算),待溴酚兰移动到一定位置,停止电泳。

4. 观察拍照


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