DNA琼脂糖凝胶电泳

利用DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时具有的电荷效应和分子筛效应。

电荷效应是指DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电，在电场中向正极移动，且相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，能以相同速率移动。通常，DNA泳动速率随DNA片段长度的增加而减少，与电场强度成正比。

分子筛效应是指作为支持介质的琼脂糖，具有网络结构，使大分子物质在通过时收到较大阻力，依此分离不同大小的DNA片段。一般，DNA琼脂糖凝胶电泳可分离50bp到百万bp长度的DNA片段，视实际需求配制不同浓度和构型的琼脂糖凝胶。

一、标准琼脂糖不同浓度分离DNA片段的范围

琼脂糖/%          分辨DNA大小的范围

    0.5                    700bp~25kb

    0.8                    500bp~15kb

    1.0                    250bp~12kb

    1.2                    150bp~6kb

    1.5                      80bp~4kb

二、电泳缓冲液配制

以Tris-乙酸盐和EDTA缓冲液（pH8.0，TAE）为例

缓冲液                工作液                                       贮存液/L

  TAE         1X                                        50X

                 40 mmol/L Tris-乙酸盐         242g Tris

                 1 mmol/L EDTA                    57.1ml 冰乙酸

                                                            100 ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）

三、琼脂糖凝胶制备

1. 将清洁干燥的塑料托盘放入配胶板，置于水平面上。

2. 配制足量的电泳缓冲液（1XTAE）用以灌满电泳槽和配制凝胶。

3. 根据欲分离DNA片段大小用电泳缓冲液配制适宜浓度琼脂糖溶液：准确称量琼脂糖干粉加到盛有定好量的电泳缓冲液的三角烧瓶或玻璃瓶中。

4. 在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。

5. 用隔热手套或夹子转移三角烧瓶或玻璃瓶到55℃水浴。待熔化的凝胶稍冷却后加入溴化乙锭，终浓度为0.5 μg/ml。轻轻地旋转以充分混匀凝胶溶液。

6. 琼脂糖溶液正在冷却时，用一个合适的梳子形成加样孔。梳齿的位置应在托盘底面上0.5~1.0mm，这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要求的加样孔。

7. 浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具，室温下放置30~45min，待凝胶溶液完全凝结，小心拔出梳子。

四、DNA电泳

1. 将凝胶安放在电泳槽内，向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm。

2. 混合DNA样品和一定比例的载样缓冲液。

3. 用微量移液器及一次性吸头将样品混合液缓慢加至浸没凝胶的加样孔内。分子质量标准应分别加至样品孔的左侧和右侧的两个孔内。

4. 关上电泳槽盖，接好电极插头。DNA应向阳极（红色插头）侧泳动。给予1~5V/cm的电压，其中距离以阳极至阴极之间的测量为准。

5. 当DNA样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时，关上电源、拔出电极插头和打开电泳槽盖，用紫外灯观察凝胶和拍照。

2. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，熔化的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。

3. 电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应经常更新电泳缓冲液。

4. 样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5微克的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA片段的数量和大小而定。当加样孔大时，样品上样量应相应加大，否则会造成条带浅甚至辨认不清；反之则应适当减少加样量，因为上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾或弥散，对于较大的DNA片段，此现象更明显。

5. DNA样品中盐浓度会影响DNA迁移率，平行对照样品应使用相同的缓冲条件以消除这种影响。

6. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度、迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以提高分辨率。

常见问题原因分析

1. 跑出的DNA带模糊？

（1）DNA降解：避免核酸酶污染。

（2）电泳缓冲液不新鲜：电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。

（3）所用电泳条件不合适：电泳时电压不应超过20V/cm，温度<30℃；巨大DNA链电泳，温度应<15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。

（4）DNA上样量过多：减少凝胶中的DNA上样量。

（5）DNA样含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。

（6）有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白。

（7）DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。

2. 有不规则DNA带迁移？

（1）对于λ/Hind III片段cos位点复性：电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟。

（2）电泳条件不合适：电泳时电压不应超过20V/cm，温度<30℃；经常更换电泳缓冲液。

（3）DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。

3. 跑出的DNA条带弱或无条带？

（1）DNA的上样量不够：增加DNA的上样量。

（2）DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。

（3）DNA走出凝胶：正确连接电极方向避免插反的情况，缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。

（4）所用光源不合适：对于用EB染色的DNA应用短波长（254nm）紫外光源。

4. 跑出的DNA带缺失不完整？

（1）如果是小DNA带，可能跑出凝胶，可以缩短电泳时间或降低电压或增强凝胶浓度。

（2）分子大小相近的DNA带不易分辨，应延长电泳时间，并核准正确的凝胶浓度。

（3）DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。