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DNA实验

用碱性磷酸酶进行DNA片段的去磷酸化

2024-05-20 DNA实验 加入收藏
材料与仪器牛小肠碱性磷酸酶 虾碱性磷酸酶 蛋白酶 K 限制性内切核酸酶 DNA 样品氯仿 EDTA 乙醇 酚 氯仿 SDS 醋酸钠 TE Tris-Cl CIP


材料与仪器

牛小肠碱性磷酸酶 虾碱性磷酸酶 蛋白酶 K 限制性内切核酸酶 DNA 样品
氯仿 EDTA 乙醇 酚 氯仿 SDS 醋酸钠 TE Tris-Cl CIP 去磷酸化缓冲液 SAP 去磷酸化缓冲液
水浴或加热板

步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

氯仿

EDTA ( 0.5 mol/L,pH 8.0) 或 EGTA ( 0.5 mol/L,pH 8.0) (如使用 CIP)

乙醇

酚:氯仿(1:1,V/V)

SDS (10% m/V)( 如使用 CIP)

醋酸钠(3 mol/L,pH 7.0 [ 如使用 CIP] 和 pH 5.2)

TE ( pH 7.6)

Tris-Cl(1 mol/L,pH 8.5)

2. 酶和缓冲液

牛小肠碱性磷酸酶(CIP) 或虾碱性磷酸酶(SAP) (US Biochemical 公司, Boehringer Mannheim 公司或 Worthington Biochemicals 公司)

10X CIP 去磷酸化缓冲液或 10X SAP 去磷酸化缓冲液

蛋白酶 K

限制性内切核酸酶

3. 核酸和寡核苷酸

DNA 样品(0.1~10 μg [ 1-100 pmol])

4. 专用设备

预先设定至 56℃、65℃ 或 75℃ (CIP) 或 70℃ (SAP) 水浴或加热板



二、方法

1. 用所选择的限制性内切核酸酶完全消化 1~10 μg (10~100 pmol) DNA 使去磷酸化。

2. 用 CIP 或 SAP 使已经限制酶切的 DNA 5' 端去磷酸化。

(1) 用 CIP 进行 DNA 的去磷酸化

① 向 DNA 中加入:

10X CIP 去磷酸化缓冲液  5 μl

水                                 加至 48 μl

② 加入适量的 CIP。

③ 37℃ 温育反应 30 min 后,加入第二等份 CIP,继续温育 30 min。

④ 在温育反应结束后,加入 SDS 和 EDTA(pH 8.0) 至终浓度分别为 0.5% 和 5 mmoI/L 以灭活 CIP,充分混匀备试剂,再加入蛋白酶 K 至终浓度为 100 μg/ml,56℃ 下温育 30 min。

⑤ 将反应冷却至室温,先用酚: 氯仿抽提 2 次,再以氯仿单独抽提 1 次以纯化 DNA。

(2) 用 SAP 进行 DNA 去磷酸化

① 向 DNA 中加入:

10X SAP 去磷酸化缓冲液     5 μl

水                                      加至 48 μl

② 加入适量的 SAP。

③ 37℃ 温育反应 1 h。

④ 为灭活 SAP,将反应转移至 70℃ 加热 20 分钟,然后冷却至室温。

3. 将水相转移至一个清洁的微量离心管中,如用 SAP,则在 0.1 体积的 3 mol/L 醋酸钠(pH 5.2) 的存在下用标准乙醇沉淀回收 DNA;如使用 CIP,则用 0.1 体积的 3 mol/L 醋酸钠(pH 为 7.0)。

4. 室温下干燥沉淀物,然后溶于 TE (pH 7.6),使 DNA 的浓度 > 2 nmol/ml。



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