Omega质粒小量提取流程

一、实验试剂

1. 使用前，将RNase A全部加入Solution I中并于4度保存。

2. 按下表用无水乙醇稀释DNA Wash Buffer，并于室温保存。

D6948-00B: 加入8 ml无水乙醇。

D6948-01B: 加入80 ml无水乙醇。

D6848-02B: 加入80 ml无水乙醇。

二、实验步骤

1. 取1.5-5 ml 菌液10 000 x g室温离心1min收集菌体沉淀；

2. 小心去除上清液，加250 ul Solution I/RNase，涡旋或用移液枪上下吹打重悬菌体。

3. 加250 ul SolutionⅡ，来回颠倒4- 6次轻柔混匀，得到澄清的裂解液。

4. 加125 ul Buffer N3，颠倒混匀几次直至出现白色絮状沉淀，室温放置2-3 min让其充分反应。

5. 12 000×g 室温或4℃离心10 min得上清，把上清转移到一个新的离心管内；

6. 加入与上清等体积的ETR Binding Buffer，颠倒混匀7-10次，室温放置5 min。

7. 结合质粒——把结合柱插入2 ml收集管，每次转移700 ul混合液至结合柱柱里，8 000×g离心1 min，弃滤液。

8. 重复第7步，直至所有上清都过滤完，弃滤液。

9. 加入500 ul ETR Wash Buffer到结合柱上，8 000×g离心1 min，使全部液体滤过柱子，弃滤液。

10. 加入500 ul Buffer EHB到结合柱上，8，000×g离心1min，使全部液体滤过柱子，弃滤液；

11. 加入700 ul DNA Wash Buffer到结合柱上， 8 000×g离心1 min使全部液体滤过柱子，弃滤液；

注意：浓缩的DNA Wash Buffer在使用之前必须按标签的提示用无水乙醇稀释。

12. 加入700 ul DNA Wash Buffer到结合柱上，8 000×g离心1 min使全部液体滤过柱子，弃滤液；

13. 把空柱子套回离心管，最大转速（不超过13 000×g）离心2 min干燥柱子；

14. 把结合柱套在一个新的1.5 ml离心管中，加入30-50 ul Endotoxin-Free Elution Buffer，室温放置2-5 min，最高转速离心1 min洗脱质粒DNA。