简并寡核苷酸诱变实验（小段DNA序列中产生大量突变）
材料与仪器大肠杆菌DNA聚合酶 dNTP 甘油 NaCl EDTA SDS 无水乙醇水浴锅 离心机 分光光度计步骤1. 设计寡核苷酸，其3‘端含有由8个核苷酸
材料与仪器
大肠杆菌
DNA聚合酶 dNTP 甘油 NaCl EDTA SDS 无水乙醇
水浴锅 离心机 分光光度计
DNA聚合酶 dNTP 甘油 NaCl EDTA SDS 无水乙醇
水浴锅 离心机 分光光度计
步骤
1. 设计寡核苷酸，其3‘端含有由8个核苷酸组成的回文结构，且包含某一限制性内切酶的识别位点；如果可能的话，5’端也应有一含某个限制性内切酶位点的序列。中间区段则应含目的诱变区。
图一、简并寡核苷酸的设计
2. 寡核苷酸的合成。在无需突变的位置时，用一种核苷酸前体的同质溶液进行合成，而在需要突变的位置时，则用特定的核苷酸前体混合物来控制合成反应的进行。
3. 通过HPLC和（或）含7 mol/l 尿素的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化每核苷酸，用水调整浓度至1 mg/ml。
4. 取200 pmol （1~2 μg）寡核苷酸加至一个500 μl 的微量离心管中，加水至7 μl 温育5 min。
4. 取200 pmol （1~2 μg）寡核苷酸加至一个500 μl 的微量离心管中，加水至7 μl 温育5 min。
5. 加1 μl 10×DNA聚合酶1缓冲液，降温至适合3‘端回文结构杂交的温度，保温不少于60 min。
6. 加2 μl 2.5 mmol/l 4种dNTP混合液，5 U klenow酶，再加10 μCi的任意一种［α-32P］，23℃保温1 h。另加入5 U的klenow酶继续温育2 h或过夜。
7. 加1 μl 0.5 mol/l EDTA终止反应，加TE缓冲液至总体积为50 μl，加乙酸钠至终浓度为0.3 mol/l。用缓冲液平衡酚抽提，无水乙醇沉淀DNA。DNA重悬于20 μl TE缓冲液。取出2 μl 留待作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析之用。
8. 在30 μl 反应体积内，每微克塞核苷联用10~40 U 的识别外侧限制性酶切位点的酶消化双链寡核苷酸2 h 以上，如寡核苷酸5’端无限制性内切酶位点，则用识别内侧限制性内切酶位点的酶切割。
9. 取出2 μl 留待作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳之用，余下的用缓冲液平衡酚抽提，无水乙醇沉淀，在重悬于不少于10 μl 的TE缓冲液，然后用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。
10. 切下双链DNA所在的胶，并用凝胶洗脱缓冲液将其洗脱出来，用20 μl 的TE缓冲液重悬，贮存于-20℃。
11. 用识别内侧酶切位点（位于原来的寡核苷酸的3’端）的限制性内切酶消化双链寡核苷酸，以生成一同源双链寡核苷酸混合物，其5’和3’端适于将它们连接进常规的的载体中去。取留待作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳之用，剩余的用酚抽提， 乙醇沉淀，重悬于20 μl 缓冲液。
12. 步驟7、9、11中留取的2 μl 液体用变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，以证实各步反应均产生了所要的产物。
13. 按系列稀释法用TE缓冲液从10到10 000倍系列稀释双链寡核苷酜，设置一系列的连接反应，每个反应均含有恒量的载体和部分上述稀释液。
14. 用常规的转化方法将连接反应物转化进适当的大肠杆菌。通过限制性内切酶酶切和DNA序列测定来分析所得的DNA。
11. 用识别内侧酶切位点（位于原来的寡核苷酸的3’端）的限制性内切酶消化双链寡核苷酸，以生成一同源双链寡核苷酸混合物，其5’和3’端适于将它们连接进常规的的载体中去。取留待作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳之用，剩余的用酚抽提， 乙醇沉淀，重悬于20 μl 缓冲液。
12. 步驟7、9、11中留取的2 μl 液体用变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，以证实各步反应均产生了所要的产物。
13. 按系列稀释法用TE缓冲液从10到10 000倍系列稀释双链寡核苷酜，设置一系列的连接反应，每个反应均含有恒量的载体和部分上述稀释液。
14. 用常规的转化方法将连接反应物转化进适当的大肠杆菌。通过限制性内切酶酶切和DNA序列测定来分析所得的DNA。
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