小麦高通量微卫星分析的DNA改良快速提取法

本研究采用国际麦类染色体制图动 议(ITMI)的小麦群体的亲本Opata、W-7984，种子在8格的长方形组培盘中进行，盘中放发芽纸(2.5×3cm)，每格10粒种子，加水。将培养盘置于25℃的黑暗条件下24小时，然后在温度为27℃、日长为16小时的条件让其发芽，时间为72小时。一套材料立即提取DNA，另一套材料放在具96格的培养盘中，贮藏在零下20℃条件下，不加缓冲液，贮藏30天后再提取DNA。

DNA提取

从三个幼苗上取1.5cm湿重为0.2g萌发的幼苗和胚芽鞘组织。将组织放在96格平底组培盘中，组培盘置于冰上，直接向每格的组织中加入 0.25M NaOH40µl。将盘在95℃水浴中1分钟。比较三种不同离析技术的优劣。采用手工方法 用研磨棒将96个样本研细。为了一次离析96个样本，采用了手动96针的重复因子。最后，用 Matrix Mill基质研磨器对组织进行机械离析，间隔时间为1、3、5、7、10分钟。培养 盘的每格中加入130µl 0.1M Tris-HCl，pH8.0。将培养盘在2250×g下离心10分钟。去掉150µl上清液后放在 0.2ml圆锥底、96格的PCR盘中。用15µl 3M NaOAC，pH 5.2和120µL 100%异丙醇沉淀DNA。 样本在-80℃下放置1小时，将PCR盘在2250×g下离心30分钟，使DNA成小团。将盘在纸巾上轻轻敲打，将盘倒立，离心1分钟，转速1200×g，去掉上清液。用700mL/L EtOH/H2 O中的 200µL冲洗DNA小球，再在2250×g下离心20分钟。将盘倒立在1200×g下离心2分钟，去掉乙醇。再将DNA在20µL 1×TE（10mM Tris-HCl，1mM　&Epsilon；DTA）缓冲液(pH8.0)中重悬浮。DNA 在-20℃下贮藏30天。用GeneQuant Pro光谱仪定量分析每个提取样的DNA数量。每个组织的取样和处理都重复3次。

PCR扩增

依赖小麦微卫星引物gwm 493、gwm533 分析DNA的量。正向引物的5&prime；端用FAM、NED标记。由2µL DNA提取物(＜0.1-0.26µg/µL )、500p mol正向和反向引物、0.25mM dNTP、无MgCl2的 1×PCR缓冲液、2.5mM MgCl2 、1 .25个单位的Taq DNA聚合酶组成的25µL反应液获得扩增子。扩增循环步骤为最初在94℃下 3分钟使DNA变性，然后再在94℃下变性1分钟，引物退火1分钟(60℃)，扩散2分钟(72℃)， 这3个步骤循环35次，最后在72℃下扩散10分钟。

电泳和DNA片断分析

利用凝胶电泳证明PCR扩增，在50V电压下电泳4小时，利用1×TBE缓冲液(45mM Tris-硼酸、1mM EDTA)，2.3%(W/V)SFR琼脂凝胶进行电泳。用带36cm毛细管的ABI 3100 Prism遗传分析仪分析DNA片断。

结果与讨论

利用发芽培养盘是为了充分利用从萌发的幼苗提取DNA的能力，利用发芽盘可以避免占用温室空间，而且从种子到DNA提取的时间很短。评价了发芽盘是否方便以及空间利用情况，最终选用8格的长方形培养盘。种子在过滤纸上可以产生足够DNA提取用的组织，这种提取不是完全破坏性的，需要的幼苗还可以种植在土壤中作进一步的研究或检测其后代或获得大量DNA。分离的组织可以轻易地转移到96格的标准实验自动化设备中。8格盘可以有效利用空间，可以在有限的生长箱中放置大量的培养盘。而且这些盘又大到可以清洗干净后再利用。

我们对Dayteg等(1998)的DNA提取过程进行了改良。在优化提取过程中，我们考虑了组织离析和DNA质量的问题。比较了不同的离析技术。每个样先用研磨棒研磨，还立即用96针的重复因子离析96个样。用手研磨的都不能为扩增PCR产物提供足够的DNA。Matrix研磨机是将不锈钢的小型圆柱体放入96格的每个格中，也用于组织离析，设备内的磁力驱动不锈钢柱转动，从而离析植株组织。比较了1、3、5、7、10共5种离析时间对DNA提取量的影响，测定了DNA 浓度。不同的离析时间和同一离析时间但组织材料处理不同(鲜组织和冷冻组织)的其DNA浓 度不同。从DNA浓度来看，没有一个离析时间更优越。和手工操作相比较，利用Matrix研磨 机，可以提高DNA的分离量，同时可以缩短磨样的时间，使手工磨样时一个样1分钟变成机 器磨样时的96个样7～10分钟。

将离析时间选为7～10分钟，拓宽这种方法的应用范围， 使得可以使用不同苗龄的组织，既可使用新鲜组织也可使用冷冻组织在标记辅助选择时提 供足够的DNA供扩增分析是关键。不同研磨时间提取的DNA用作PCR扩增。PCR扩增试验进行 了四个处理以及不同的组织类型，包括鲜组织分离的贮备DNA、鲜组织分离的新鲜DNA、冷 冻组织分离的新鲜DNA。用CTAB提取的DNA进行质量对比。选用了微卫星标记和小麦品系，由于预期的带型特征很清楚。利用琼脂凝胶证实了PCR产物存在，用毛细电泳法分析了PCR 产物。gwm493的W-7984片断为170个碱基对(bp)，新鲜的和冷冻的材料gwm533的CTAB提取DN A片断分别为116 bp、166bp。所有处理的Opata片断为137 bp(gwm 493)和113、116bp(gwm5 33)。各种DNA提取方法得到的DNA没有明显的片断大小差异。而且，新鲜组织和在-20℃下 贮藏30天的组织进行DNA快速提取后得到的DNA的质量没有差异。