Login
欢迎浏览恩派尔生物资料网
我要投稿 请登录 免费注册 安全退出

请输入关键字词

热门文章排行

您现在的位置是： 首页 > 实验方法 > DNA实验

DNA实验

毛细管电泳法分析单链构象多态性实验（基本方案1 毛细管电泳的样品准备）

电泳法
2024-05-30 DNA实验 加入收藏
材料与仪器5‘-FAM 荧光素标记的正向引物 5‘-HEX 荧光素标记的反向引物dNTP 10 X PCR 缓冲液 DNA 聚合酶 Milli-


材料与仪器

5'-FAM 荧光素标记的正向引物 5'-HEX 荧光素标记的反向引物
dNTP 10 X PCR 缓冲液 DNA 聚合酶 Milli-Q 系列超纯水 MgSO4 琼脂糖凝胶 基因扫描胶 遗传分析仪缓冲液 甘油溶液 去离子甲酰胺 NaOH DNA 大小标准品
PCR 管 热循环器 聚丙烯管 遗传分析仪

步骤

1.计算P C R 引物的理论Tm 值。用软件或通用的标准计算。用下面的退火温度： Tm (理论）一5°C 。 2. 准备5 个 25m l 的 P C R 反应体系，在冰水混合物中混合下列物质（ 乘以5): I. 25/J 20； xm〇 l/L 5卞A M 荧光素标记的正向引物（ 最终稀释为ljumol/L) 1.25pJ 2(V m d / L 5'H E X 荧光素标记的反向引物（ 最终稀释为 0 • (每种 10mmol/L ) dNTP (最终稀释为 200pmol/L ) 2. 54 10X P C R 缓 冲 液 （ 最终稀释为I X ) 0. IjlJ 5U / W D N A 聚 合 酶 （ 最终稀释为 0. 5U /25jul)。 3. 准备5 个 0.2ml P C R 管，在冰水混合物中将下列物质分别加入到标记的管中。 a. IjuI 20 〜 60ng/V 基因组 D N A ， 17. 9/J milli-Q 系列超纯水， 〇.5yl 25 mmol/L M g S O 4; b. Ijul 20 〜 60ng/V 基因组 D N A ， 17. 4/J milli-Q 系列超纯水， I.Oyl 25 mmol/L M g S O 4; c. Ipl 20 〜 60ng/V 基因组 D N A ， 16. 系列超纯水， 1. 54 25 mmol/L M g S O 4； d lpl 20〜 60叩 /4基 因 组 D N A ， 1 6 . milli-Q 系列超纯水， 2.〇 W 25 mmol/L M g S O 4; e. 1M120〜eOng/jul 基因组 D N A ， 15. 系列超纯水， 2. 54 25 mmol/L T MgSO4o 4. 加 5. 6 4 的 P C R 反应混合物到每个0. 2m l 的 P C R 管。制冷。保存在冰水混合物中。 5.用下面设定程序的热循环仪扩增D N A 片段。 1 个循环： 4min 94°C (变性） 34个循环： 20s 94°C (变性） 20s x°C (理论 T tn值一5°C ; 退火） 40s 72°C (延伸） 1 个循环： 7min 72°C (延伸） 将热循环仪的盖子打开启动热循环仪，在热盖的温度>85°C 时，尽快将P C R 管 从冰水浴中转移到热盖上。关上热循环仪的盖子。 6. 用 2 % 的琼脂糖凝胶通过琼脂糖凝胶电泳分析IOjUl P C R 产 物 （ 附录3G )，选择能够 使正常片段大小的带清晰显现的MgSO4 浓度。 7. 准备48个 25jlJ P C R 反应体系。在冰水浴中混合下列物质： I. 25W ZOjumol/L 5卞A M 荧光素标记的正向引物（ 最终稀释为1/xmol/L ); I. 25^ 20/^mol/L 5 ' H E X 荧光素标记的反向引物（ 最终稀释为ljumol/L);

相关文章

文章底部广告位

文章评论

加载中~