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DNA实验

DEAE membrane吸附法分离与纯化DNA片段

2024-10-16 DNA实验 加入收藏
利用离子交换的原理,在低盐情况下使DNA 吸附在带正电荷的滤膜上,再利用含有高浓度盐类的缓冲液将DNA 自膜上溶离下来。仪器用具:Mupid II 迷你电泳槽;

利用离子交换的原理,在低盐情况下使DNA 吸附在带正电荷的滤膜上,再利用含有高浓度盐类的缓冲液将DNA 自膜上溶离下来。

仪器用具:Mupid II 迷你电泳槽;UV transilluminator;防护面罩;扁平药匙;干净刀片;65℃水浴或恒温槽

药品试剂:

经BamHI 及HindIII 作用的pBlueGus 及pQE31

含EtBr 的1.0 % 12-well agarose gel

1×NET (20 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 0.1 mM EDTA, pH 8.0)

High salt NET (20 mM Tris-HCl; 1.0 M NaCl; 0.1 mM EDTA, pH 8.0)

0.5 M NaOH;10 mM EDTA;TE-8.0;n-Butanol

Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (PCI, 25:24:1)

Chloroform/isoamyl alcohol (CI, 24:1)

10 M ammonium acetate (NH4OAc)

DEAE membrane (Schleicher & Schuell, NA 45)

过滤膜 (Millipore VSWP 01300, 0.025 μm, 13 mm)

方法步骤:

1) 经BamHI 及HindIII 作用的pBlueGus 及pQE31,置65℃水浴10 min,移至冰浴降温后,以含EtBr 的1.0% agarose gel 进行电泳。

2) NA 45 以灭过菌的剪刀剪成适当大小,置于培养皿中,以10 mM EDTA-8.0浸泡处理10 min,继以0.5 M NaOH 处理5 min. 以无菌水快速清洗五、六次后,浸泡于无菌水中,置于4℃可保存数周。

3) 电泳后的胶片以EtBr 染色后,以长波长UV 灯观察DNA 片段所在位置,并在DNA 色带前后切一刀,以扁平药匙辅助将NA 45 插入DNA 前后的切缝中;再以UV 灯观察NA 45 插入的位置是否恰当。

4) 将胶片置回电泳槽中,以100 V 进行电泳约10 min (时间随NA 45 位置与DNA 距离而定);以UV 灯观察DNA 是否完全吸附到NA 45.

5) 将NA 45 取出,浸于NET中漂洗以去除附着于NA 45 的胶体 (可用微量移液器头末端将胶体轻轻去除),再移置于微量离心管中 (每2~3 片置于一管中),吸去多余的液体。

◆ 注意! 不可让NA 45 干掉,否则DNA无法被溶离下来。

6) 加入0.3 mL high salt NET,于68℃加热40 min,其间不时震荡。

◆ NA 45 膜片避免重迭在一起,并且必须完全浸泡于溶液中。

7) 将溶液吸出,原管中的NA 45 再加入300 μL high salt NET,于68℃加热10min.

◆ 以下的步骤常容易出错,请务必分清楚离心后该取上层或下层溶液,请先保留各部份的溶液,确定无误后再丢弃。


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