寡核苷酸5'末端磷酸化实验
材料与仪器T4噬菌体多核苷酸激酶缓冲液 Tris-Cl T4噬菌体多核苷酸激酶 寡核苷酸 [γ-32P]ATP微量离心管 水浴箱步骤材料缓冲液与溶液稀释贮存液至
材料与仪器
T4噬菌体多核苷酸激酶缓冲液 Tris-Cl T4噬菌体多核苷酸激酶 寡核苷酸 [γ-32P]ATP
微量离心管 水浴箱
微量离心管 水浴箱
步骤
材料
缓冲液与溶液
稀释贮存液至适当浓度
10XT4噬菌体多核苷酸激酶缓冲液
Tris-Cl(1mol/L,pH8.0)
酶和缓冲液
T4噬菌体多核苷酸激酶
野生型T4噬菌体多核苷酸激酶是一种5‘磷酸转移酶和一种3'-磷酸酶(Depew and Cozarelli 1974;Sirotkin et al,1978)。而突变型酶（请见Cameron et al.1978)己失去磷酸酶活性而完全保留了磷酸转移酶活性，且可通过商品渠道获得（Behringer Mannheim公司）。因此，如可能，我们推荐使用突变型酶进行5'端标记。催化10~50pmol的5’端无磷酸末端的磷酸化需要10-20单位酶。
重要：不同商家提供的多核苷酸激酶催化单链合成寡梭苷酸5‘端磷酸化的活性有很大的差异（van Houten et al.1998)
核酸和寡核苷酸
寡核苷酸
为了达到最好的标记效果，按方案1提供的方法，用反相层析法纯化寡核苷睃。多核苷酸激酶催化粗制寡核苷酸的标记效率很低（vanHoutenetftL1998)、如使用未经纯化的寡核普酸，必须确保合成的最后一轮循环要设置三苯甲基关闭程序，即将寡核苷酸从固相载体解下之前，寡核苷酸引货的二甲氧三苯甲基封闭基团必须被除去。二甲氧二苯甲基封闭基团能有效地阻止寡核苷酸5'端羟基的修饰。
放射性化合物
[γ-32P]ATP(10mCi/ml, 比活度>5000Ci/mmol)溶液
标记10pmol髙比活度的5'端无磷酸末端需要10pmol的[>32P]ATP。为最大限度地减少前体化合场及探针的放射分解，尽可能在 [32P]ATP 到达的当天标记。
专用设备
微量离心管（0.5 ml)
预溫至 68°C 的水浴
附加试剂
本方案步骤 4 需要的试剂列于第 13 章的方案 7 或本章的方案 5。
方法
1. 在0.5 ml微量离心管中配制反应混合液
合成寡核苷酸（10pmol/ul) 1ul
10xT4 噬菌体多核苷酸酶缓冲液 2ul
[γ-32P]ATP(10pmol, 比活度>5000Ci/mmol) 溶液 5ul
水 11.4ul
持续轻弹离心管壁将反应混合液充分混匀，取 0.5ul 反应混合液，加入含 l0ul 10 mmol/LTris-Cl(pH8.0) 的离心管中，待步骤 4 时使用。
反应液中含等浓度的 [γ-32P]ATP 和寡核苷酸。通常只有 50% 的放射性标记物转移到寡梭苷酸上，增加 10 倍的寡核苷酸浓度可使转移效率提高达 90％。然而, 放射性标记寡核苷酸的比活度亦随之降低约 5 倍。为标记最高比活度的寡核苷酸, 可采用下列措施：
•增加 3 倍 [γ-32P]ATP 在反应液中的浓度（即用 15ul 放射性标记物，而减少水的体积至 1.4ul)。
•寡核苷酸量降至 3pmol。
在此条件下，仅约 10% 放射性标记物被转移到寡核苷酸上，但寡核苷酸放射性标记的比例却很高。
理想的条件下，ATF 应 5 倍摩尔过量于 DNA 末端的浓度应大于 0.4pmol/L，由此 ATP 在反应液中的浓度应大于 2umol/L, 但实际情况下很难做到。
2. 在剩余的反应混合液中加入 10 单位（~1ul)T4噬菌体多核苷酸激酶，充分混匀后，于 37°C 温育 1h。
3. 在温育反应结束时，取 0.5ul 反应液，移入第二个含 10ul 10 mmol/LTris-Cl(PH8.0) 的离心管中。其余的反应液在 68°C 下加热 10min 以灭活多核苷酸激酶。将加热过的反应液保存在冰中。
4. 进行下一步骤之前，先检测取出的小份标记反应液，通过测定寡核苷酸底物中放射性标记物的转移来确定标记反应是否有效。取一份样品 (0.5ul) 加入一只新的含 10ul 10mmol/LTris-Cl(pH8.0) 的离心管中。将这份样品与试验步骤 1 和步骤 3 取出的样品，用下列方法之一检测γ-32P 的转移效率。
•测定结合于 DE-81 滤膜的放射性比例。寡核苷酸与这种带正电核的滤膜可牢固结合，而 [γ-32P]ATP 不能与之结合。详细方法可参阅第 13 章的方案 7。
或
•用 G-15 或 Bio-Rad P-60 柱大小排阻层析，估算随寡核苷酸迁移的放射性标记组分，测定标记反应的效率。详细方法参阅本章方案 5。相比之下，此方法更简单，因为掺入与未掺入的放射性活度量在层析柱上即可用手提式微型探测仪检测。
5. 如果寡核苷酸的比活度尚可接受，可用方案 3、4、5、6 纯化放射性标记的寡核苷酸。
如比活度过低，可再加入 8 单位多核苷酸激酶，在 37°C 继续温育 30 min(共 90 min)。于 68°C 加热灭活多核苷酸激酶 10 min, 再用步骤 4 所述方法分析反应产物。
如果增加一轮鱗酸化反应产生的寡核苷酸仍不能满足当前实验对比活度要求，应检査寡核苷酸 5'末端是否含胞嘧啶，如果是的话，应考虑重新设计寡核苷酸，使其 5’末端为 A,T 或 G（见本方案概论）。此外，可尝试用 Sep-Pak 层析纯化初始寡核苷酸，然后重复本实验。
缓冲液与溶液
稀释贮存液至适当浓度
10XT4噬菌体多核苷酸激酶缓冲液
Tris-Cl(1mol/L,pH8.0)
酶和缓冲液
T4噬菌体多核苷酸激酶
野生型T4噬菌体多核苷酸激酶是一种5‘磷酸转移酶和一种3'-磷酸酶(Depew and Cozarelli 1974;Sirotkin et al,1978)。而突变型酶（请见Cameron et al.1978)己失去磷酸酶活性而完全保留了磷酸转移酶活性，且可通过商品渠道获得（Behringer Mannheim公司）。因此，如可能，我们推荐使用突变型酶进行5'端标记。催化10~50pmol的5’端无磷酸末端的磷酸化需要10-20单位酶。
重要：不同商家提供的多核苷酸激酶催化单链合成寡梭苷酸5‘端磷酸化的活性有很大的差异（van Houten et al.1998)
核酸和寡核苷酸
寡核苷酸
为了达到最好的标记效果，按方案1提供的方法，用反相层析法纯化寡核苷睃。多核苷酸激酶催化粗制寡核苷酸的标记效率很低（vanHoutenetftL1998)、如使用未经纯化的寡核普酸，必须确保合成的最后一轮循环要设置三苯甲基关闭程序，即将寡核苷酸从固相载体解下之前，寡核苷酸引货的二甲氧三苯甲基封闭基团必须被除去。二甲氧二苯甲基封闭基团能有效地阻止寡核苷酸5'端羟基的修饰。
放射性化合物
[γ-32P]ATP(10mCi/ml, 比活度>5000Ci/mmol)溶液
标记10pmol髙比活度的5'端无磷酸末端需要10pmol的[>32P]ATP。为最大限度地减少前体化合场及探针的放射分解，尽可能在 [32P]ATP 到达的当天标记。
专用设备
微量离心管（0.5 ml)
预溫至 68°C 的水浴
附加试剂
本方案步骤 4 需要的试剂列于第 13 章的方案 7 或本章的方案 5。
方法
1. 在0.5 ml微量离心管中配制反应混合液
合成寡核苷酸（10pmol/ul) 1ul
10xT4 噬菌体多核苷酸酶缓冲液 2ul
[γ-32P]ATP(10pmol, 比活度>5000Ci/mmol) 溶液 5ul
水 11.4ul
持续轻弹离心管壁将反应混合液充分混匀，取 0.5ul 反应混合液，加入含 l0ul 10 mmol/LTris-Cl(pH8.0) 的离心管中，待步骤 4 时使用。
反应液中含等浓度的 [γ-32P]ATP 和寡核苷酸。通常只有 50% 的放射性标记物转移到寡梭苷酸上，增加 10 倍的寡核苷酸浓度可使转移效率提高达 90％。然而, 放射性标记寡核苷酸的比活度亦随之降低约 5 倍。为标记最高比活度的寡核苷酸, 可采用下列措施：
•增加 3 倍 [γ-32P]ATP 在反应液中的浓度（即用 15ul 放射性标记物，而减少水的体积至 1.4ul)。
•寡核苷酸量降至 3pmol。
在此条件下，仅约 10% 放射性标记物被转移到寡核苷酸上，但寡核苷酸放射性标记的比例却很高。
理想的条件下，ATF 应 5 倍摩尔过量于 DNA 末端的浓度应大于 0.4pmol/L，由此 ATP 在反应液中的浓度应大于 2umol/L, 但实际情况下很难做到。
2. 在剩余的反应混合液中加入 10 单位（~1ul)T4噬菌体多核苷酸激酶，充分混匀后，于 37°C 温育 1h。
3. 在温育反应结束时，取 0.5ul 反应液，移入第二个含 10ul 10 mmol/LTris-Cl(PH8.0) 的离心管中。其余的反应液在 68°C 下加热 10min 以灭活多核苷酸激酶。将加热过的反应液保存在冰中。
4. 进行下一步骤之前，先检测取出的小份标记反应液，通过测定寡核苷酸底物中放射性标记物的转移来确定标记反应是否有效。取一份样品 (0.5ul) 加入一只新的含 10ul 10mmol/LTris-Cl(pH8.0) 的离心管中。将这份样品与试验步骤 1 和步骤 3 取出的样品，用下列方法之一检测γ-32P 的转移效率。
•测定结合于 DE-81 滤膜的放射性比例。寡核苷酸与这种带正电核的滤膜可牢固结合，而 [γ-32P]ATP 不能与之结合。详细方法可参阅第 13 章的方案 7。
或
•用 G-15 或 Bio-Rad P-60 柱大小排阻层析，估算随寡核苷酸迁移的放射性标记组分，测定标记反应的效率。详细方法参阅本章方案 5。相比之下，此方法更简单，因为掺入与未掺入的放射性活度量在层析柱上即可用手提式微型探测仪检测。
5. 如果寡核苷酸的比活度尚可接受，可用方案 3、4、5、6 纯化放射性标记的寡核苷酸。
如比活度过低，可再加入 8 单位多核苷酸激酶，在 37°C 继续温育 30 min(共 90 min)。于 68°C 加热灭活多核苷酸激酶 10 min, 再用步骤 4 所述方法分析反应产物。
如果增加一轮鱗酸化反应产生的寡核苷酸仍不能满足当前实验对比活度要求，应检査寡核苷酸 5'末端是否含胞嘧啶，如果是的话，应考虑重新设计寡核苷酸，使其 5’末端为 A,T 或 G（见本方案概论）。此外，可尝试用 Sep-Pak 层析纯化初始寡核苷酸，然后重复本实验。
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