Histochemical detection重组质体的检定

操作原理与colony hybridization 相同，但是将滤膜移置于含有IPTG 及5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide （X-Gluc） 的培养基。 X-Gluc 可被GUS作用而释出蓝色的产物，若转型株所带的质体接有gus 基因的重组质体，则应可在IPTG 的诱导条件下表现出蛋白质，若此重组蛋白质具有GUS 活性，可将进入菌体的X-Gluc 分解而使菌落呈蓝色。

仪器用具：

平端镊子

药品试剂：

Nitrocellulose 滤膜

LB/Amp/IPTG/X-Gluc plate （LB plate 添加100 μg/mL ampicillin, 0.2 M IPTG,

50 μg/mL X-Gluc）

方法步骤：

1） 前一天进行转形的培养皿，当菌落长至约0.5 mm 大小时，将培养皿移至4℃放置至少1 h.

2） 准备一张无菌的硝化纤维滤膜，以铅笔在边缘标上组别。

◆ 请戴手套后再拿取滤膜！

3） 打开培养皿盖子，以两支扁平镊子将滤膜两边夹住，轻轻覆盖在菌落上方，尽可能避免有气泡产生。

◆ 注意！滤膜覆盖上去后就不要再移动！

4） 等滤膜完全湿透后，以针头在滤膜边缘戳洞做记号 （至少做三个记号）。 小心把滤膜掀起，菌落朝上放置在LB/Amp/IPTG/X-Gluc plate 上。盖上盖子，在37℃培养，若转形株带有接上gus 的质体，菌落应在1~2 h 内转呈蓝色。原培养皿则置回37℃使菌落再长出。

5） 将滤膜与原培养皿对照，标出有蓝色菌落位置。 选取数个菌落，以划单一菌落的方式分别接种在LB/Amp/plate 上，置37℃直至菌落长出。 亦同时接种于3 mL LB/Amp 培养液，于37℃震荡培养过夜，以抽取质体，进行限制酶分析。