利用PCR进行单一位点的体外基因定点突变
简介利用 PCR 的引物设计灵活性．在扩增中直接引入突变。首先设计一对引物，引物l用于导入突变位点，引物 2 与引物 1 的 5‘-端邻接、3‘
简介
利用 PCR 的引物设计灵活性．在扩增中直接引入突变。首先设计一对引物，引物l用于导入突变位点，引物 2 与引物 1 的 5'-端邻接、3'-端方向相反；利用这对引物和高保真 Taq DNA 聚合酶，以双链质粒为模板进行 PCR 反应；对 PCR 产物末端进行补平处理及 5'-端磷酸化处理；再用连接试剂进行自身连接（环化反应）；然后转化、提取突变体 DNA。本方法操作方便简单，只需一天时间便可完成整个操作，且不受载体、宿主菌的限制。当载体与插入的 DNA 片段的总长度小于 5kb 时，使用本方法较为合适；如果载体与插入 DNA 片段长度太长时，由于PCR反应能力的限制，难以收到好的效果。
原理
利用 PCR 进行单一位点的体外基因定点突变的基本原理是利用 PCR 的引物设计灵活性．在扩增中直接引入突变。首先设计一对引物，引物l用于导入突变位点，引物 2 与引物 1 的 5'-端邻接、3'-端方向相反；利用这对引物和高保真 T叨DNA 聚合酶，以双链质粒为模板进行 PCR 反应；对 PCR 产物末端进行补平处理及 5'-端磷酸化处理；再用连接试剂进行自身连接（环化反应）；然后转化、提取突变体 DNA。原理示意图如下：
材料与仪器
试剂：
引物、DNA 聚合酶、模板、大肠杆菌感受态细胞、
仪器：
PCR 仪、电泳仪、测序平台、培养箱
步骤
利用 PCR 进行单一位点的体外基因定点突变的基本过程包括以下几步：
1.PCR 反应(50µl)，体系混合均匀；
2.按下列反应条件进行 PCR 反应：94℃ 30s;
55℃ 30s;
72℃ 5min。30个循环；
3.对PCR反应液进行 1%琼脂糖凝胶电泳检测。切胶回收目的 DNA 片段；
4.DNA 片段的末端补平和连接 DNA 片段 lpmollOX 补平－磷酸化缓冲液 2µ1补平－磷酸化酶混合液 lµIH20 补充体积到20µ137 屯反应 10min,70℃ 反应 10min。
5.取约 0.2Spmol(5µ1)上述D反应完成后的溶液于新的微量离心管中。
6.加入5µ1连接溶夜，均匀混合，16℃ 反应 lh。
7.反应液全量转化至 100µ1 的大肠埃希菌感受态细胞中。
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