用大片段基因组 DNA 克隆直接筛选 cDNA实验
材料与仪器扩增缓冲液 DNA 聚合酶 DNaseI 限制性内切核酸酶 ATP 链霉亲和素-磁珠结合缓冲液 T4DNA 连接酶 热稳定 DNA 聚合酶 琼脂糖凝胶
材料与仪器
扩增缓冲液 DNA 聚合酶 DNaseI 限制性内切核酸酶 ATP 链霉亲和素-磁珠结合缓冲液 T4DNA 连接酶 热稳定 DNA 聚合酶 琼脂糖凝胶 BACDNA 缺口平移缓冲液 杂交液 平末端 cDNA Cot1 基因组 DNA 胞浆 poly(A)+RNA dNTP 溶液 DNA 分子质量标志物 寡核苷酸 阳性对照 DNA 标记化合物
自动加样尖头 盖革计数器或切伦科夫计数器 加热装置 杂交炉 振荡水浴 磁性分离装置 微量离心管 自动加样器 SephadexG-50 离心柱 顺磁珠 热循环仪 水浴
自动加样尖头 盖革计数器或切伦科夫计数器 加热装置 杂交炉 振荡水浴 磁性分离装置 微量离心管 自动加样器 SephadexG-50 离心柱 顺磁珠 热循环仪 水浴
步骤
材料
缓冲液与溶液
10x 扩增缓冲液
缓冲液中含有 0.01%(m/V) 的明胶
ATP(10 mmol/L)
2X 杂交液
1.5mol/L NaCl
40 mmol/L 磷酸钠缓冲液（pH7.2)
10 mmol/L EDTA(pH6.0)
10xDehardt’s 液
0.2%SDS
NaOH(0.lmol/L)
1X 缺口平移缓冲液
500 mmol/LTris-HCl(pH7.5)
100 mmol/LMgCl2
50 mmol/LDTT
SDS(10%)
20XSSC
链霉亲和素-磁珠结合缓冲液
10 mmol/LTris-HCl(pH7.5)
1 mmol/LEDTA(pH8.0)
1mol/LNaCl
Tris-HCl(lmol/L,pH7.5)
酶及缓冲液
DNA 聚合酶/DNaseI(5 单位/ul;Boehringer Mannheim 公司）
限制性内切核酸酶
T4DNA 连接酶
热稳定 DNA 聚合酶
凝胶
琼脂糖凝胶（1%),0.5XTBE 配制
见步骤 18.19,24 和 25
核酸与寡核苷酸
含有靶标基因组 DNA 区域的 BACDNA
纯化方法见第 4 章方案 8 或 9。
随机引发制备的平末端 cDNA
见方案 1 阶段 1。
Cot1 基因组 DNA
胞浆 poly(A)+RNA, 纯化自研究对象组织或细胞系
见方案 1 阶段 1。
DNA 分子质量标志物
dNTP 溶液，每种 dNTP 浓度 0.4 mmol/L(pH8.0), 用于缺口平移标记实验
dNTP 溶液，每种 dNTP 浓度 2.5 mmol/L(pH8.0)，用于 PCR 扩增
寡核苷酸 [10 mmol/L,TE(pH8.0) 配制]
阳性对照 DNA
阳性对照 DNA 须是已知存在于初始基因组 DNA 中的基因或表达序列标签（EST）的一部分。如没有已知基因，则在标记之前在基因组 DNA 中（按 1:1 分于比例）加入一段单拷贝对照 DNA，闻时在 cDNA 样品中加人对照 DNA, 使对照 DNA 与 cDNA 的分子比例为 1:106。应用第 9 章给出的方案之一标记 DNA 样品；标记方案的选择取决于实验目的（关于选择的讨论，参见第 9 章的导言）。
标记化合物
[a-32P]dCTP(3000Ci/mmol)
Biotin16-dUTP(0.4 mmol)
考用设备
带滤芯的自动加样尖头
盖革计数器或切伦科夫计数器
预设溫度为 14°C 和 100°C 的加热装置
带旋转轴的杂交炉，或振荡水浴
分离链霉亲和素磁珠的磁性分离装置
微量离心管（PCR 扩增用 0.5 ml 薄壁管）
带退尖头装置的自动加样器
SephadexG-50 离心柱，用 TE(pH7.6) 平衡
Steptavidin 包被的顺磁珠
可按预设扩增方案进行的热循环仪
如热循环仪不带热盖, 则须使用矿物油或封口石蜡以减少 PCR 时反应混合物的液体蒸发，使用封口石蜡不仅可以防止蒸发，还可在反应馄合物加热之前保持组分（例如引物和模板）分离，这有助于防止在反应的初始阶段引物的非特异结合（见第 8 章信息栏"热启动 PCR")。
预设溫度为 65°C 的水浴
附加试剂
本方案步骤 1 所需的试剂列在第 10 章，方案 2。
本方案步骤 2 所需的用于随机引物起始双链 cDNA 合成或用于从 cDNA 文库中扩增插入片段的试剂列在方案 1, 阶段 1 和 2。
本方案步骤 2 标记所需的试剂列在第 9 章，方案 3、5 和 6。
本方案步骤 19 和 20 所需的试剂列在第 6 章，方案 8 和 10。
方法
带接头的 cDNA 库的制备
1. 按照第 10 章方案 2, 用多聚核苷酸激酶分别对 Ooligo3 和 oligo4 的 5'末端磷酸化进行标记，将标记的两种互补的寡核苷酸按等分子比例混合（每种约 2ug)，100°C 变性 10 min, 缓慢冷至室温。这一过程中，两种寡核苷酸复性形成衔接子。将衔接子的浓度调整为 1ug/ml。
2. 以胞浆 poly(A)RNA 为材料，利用随机引发制备至少 2ug 的平末端双链 cDNA(见方案 l)。
3. 在一个无菌的 0.5 ml 微量离心管中配置以下连接反应体系：
双链平末端 cDNA(步骤 2) 2ug
寡核苷酸扩增盒混合物 3ul
(1ug/ul，来自步骤 1)
10XT4DNA 连接酶缓冲液 3ul
10 mmol/LATP 3ul
T4DNA 连接酶 (1 单位/ul) 3ul
加 H2O 至 30ul
14°C 温育 16 h。在 65°C 放置 10 min 灭活 T4DNA 连接酶。
10x 连接反应缓冲液组分已添加 ATP, 则反应混合物中可加入更大体积的载体或外源 DNA。使用商品化的含 ATP 的连接缓冲液，则无须添加 ATP。
4. 用酚: 氯仿抽提连接反应产物，结合 SephadexG-50 离心柱层析对产物进行纯化并用常规的乙醇法沉淀 DNA。沉淀干燥后重溶于 10ulTE(pH7.6)。
基因组 DNA 克隆的生物素标记
5. 利用缺口平移法在 BAC 基因组 DNA 克隆中引入生物素化的碱基。在一个无菌的 0.5 ml 微量离心管中配置以下缺口平移反应体系（对每个 BAC 基因组 DNA 分别标记):
纯化的 BAC DNA(0.1 mg/ml) 1ul
生物素-16-dUTP(0.04 mmol/L) 1ul
10x 缺口平移缓冲液 2ul
用于缺口平移的 dNTP 溶液（0.4 mmol/L) 1ul
[a-32P]dCTP(3000Ci/mmol) 1ul
DNA 聚合酶/DNaseI(5 单位/ul) 1ul
加 H2O 至 20ul
4°C 反应 2 h。
6. 对用缺口平移法进行放射性与生物素标记的产物用 Sephadex G-50 离心柱层析进行纯化，并用常规的乙醇法沉淀 DNA。沉淀重溶于 10ulTE 并-20°C 保存。
链霉亲和素磁珠的制备
7. 在一个无菌的 1.5 ml 小离心管中，用 500ul 链霉亲和素-磁珠结合缓冲液洗涤 3 mg(300ul) 磁珠三次。每次洗涤后用磁性分离装置将磁珠从结合缓冲液中取出。洗涤后磁珠重悬于链霉亲和素-磁珠结合缓冲液，浓度为 10 mg/ml。
8. 对每一标记反应都取少量产物（步骤 6) 检测其结合链霉亲和素包被的磁珠的能力。
在一个无菌的 0.5 ml 微量离心管中配置以下结合反应体系
洗涤后的链霉亲和素包被的磁珠（步骤 7) 20ul
标记的基因组 DNA 连续片段（步骤 6) 1ul
链霉亲和素-磁珠结合缓冲液 29ul
~undefined将叠连群上分别标记的每个 BAC DNA 等量混合，混合物浓度为10ng/ul。
室温温育 15 min, 中间不时温和混匀。用磁性分离装置分离磁珠，转移上清至一个无菌的 0.5 ml 微量离心管中。用盖革计数器或切伦科夫计数器检测磁珠和上清中的放射性活度。如结合的同位素与游离的同位素比例大于 8:1, 则进行直接筛选。
如结合的同位素与游离的同位素比例小于 8∶1, 可能表明步骤 5 中的 DNA 不适合标记。可在进行标记前, 对 BACDNA 再次用酚: 氯仿反复抽提并通过 SephadexG-50 离心柱层析纯化。
直接筛选（第一轮筛选）
9. 按以下步骤用 C0tlDNA 封闭或 “重复抑制” cDNA 库（来自步骤 4) 中的重复序列：
a. 在一个无菌的 0.5 ml 微量离心管中配置以下复性反应体系：
带接头的 cDNA(步骤 4) 5ul(1ug）
人基因组 C0tlDNA 5ul(1ug）
b. 在反应混合物上方加入低比重矿物油（约 50ul) 防止蒸发，然后 100°C 变性 10 min。冷却反应体系至 65°C, 向矿物池下加入 10ul 的 2X 杂交液。海和混匀后 65°C 温育 4 h。
如使用的为 YAC 基因组 DNA 靶标，则 DNA 可能为宿主（酵母）核糖体序列所污染。至少用 100ng 来源于 rRNA 的 cDNA 封闭这些序列（见本方案结尾疑难解答)。
10. 当 cDNA 库与 C0tlDNA 的杂交完成后，进行第一轮直接筛选。取 5ul(50ng) 来自步骤 6 中生物素标记的 BAC DNA 加在一个新的 0.5 ml 量微量离心管中，在反应液的上方覆盖一滴矿物油（约 50ul) 防止蒸发。100°C 变性 BAC DNA10 min 后，冷却反应体系至 65°C。
11. 在无菌的 0.5 ml 微量离心管中配置以下复性反应体系：
生物素际记的 BAC DNA(来自步骤 10) 5ul(50ng)
封闭后的 cDNA(来自步骤 9,1ug 20ul
cDNA 加 1ug C0tlDNA)
2x 杂交液 5ul
温和混勻，旋转杂交炉或振荡水裕 65°C 温育 54 h 以上。
12. 为进行基因组 DNA 与 cDNA 杂合体的捕获与洗涤，在无菌的 1.5 ml 微量离心管中加入以下试剂：
洗涤后的链霉亲和素包被的磁珠 100ul
复性反应混合物（来自步骤 11) 30ul
链霉亲和素-磁珠结合缓冲液 100ul
室温温育 15 min, 中间偶尔温和混匀。用磁性分离装置吸附磁珠，然后移除上淸。
用 1 ml1xSSC/0.1%SDS 在室温洗涤磁珠两次，每次 15 min; 然后用 1 ml 0.1xSSC/0.1%SDS 在 65°C 洗涤磁珠三次，每次 15 min。最后一次洗涤后，将磁珠转移至一新的微量离心管中。
13. 将步骤 12 中杂交在磁珠上的 cDNA 洗脱下来：
a. 加入 100ul 的 0.1mol/LNaOH, 室温放置 10 min。
b. 加入 100 的 1ml/L Tris-HCl(pH7.5)
c. 将反应混合物通过 Sephadex G-50 离心柱层析进行脱盐（见附录 8)
第一轮筛选得到的 cDNA 的扩增
14. 从洗脱下来的 200ul 的 cDNA(步骤 13) 中取三份（1ul、5ul 和 10ul) 分别加入无菌的 0.5 mlPCR 管中。
15. 在每管中各加入以下试剂：
引物 oligo3(10 mmol/L) 5ul
10XPCR 缓冲液 2.5ul
dNTP 溶液（每种 2.5 mmol/L)，PCR 用 2.5ul
Taq DNA 聚合酶（Perkin Elmer 公司，5 单位 ul) 0.2ul
加水至 25ul
按上述配置同时设置两个对照实验。阴性对照管加入上述所有试剂，但省略 cDNA 模板。第二个对照中则加入 10ng 初始 cDNA(步骤 4) 作为模板。
16. 如热循环仪不带热盖，则在反应混合物上方覆盖一滴（约 50ul) 低比重矿物油以防止蒸发。或者加入石蜡珠以应用热启动 PCR。将 PCR 管置于热循环仪上。
17. 按下表列出的变性、复性和延伸参数进行扩增反应。
18. 用 1% 琼脂糖凝胶在 0.5XTBE 电泳缓冲液中电泳分析每管中 10% 的 PCR 产物，加入适当大小的 DNA 分子质量标准。用溴化乙啶或 SYBR GOLD 染胶以显示 DNA, 估计 cDNA 扩增产物的浓度，确定能产生最大置扩增产物应加入的模板 cDNA 浓度。
成功反应的产物可见弥散的 cDNA 扩增片段, 可能带有一些清晰的条带。
19. 从每管中取等量扩增产物（每泳道约 0.5ug) 加在第 2 块 1% 琼脂糖凝胶上，同样加入适当大小的 DNA 分子质量标准。同时上样 0.5 步骤 4 中随机引发所制备的 cDNA。
20. 将分离开的 DNA 转移到膜上，通过 Southrn 印迹（第 6 章方案 8) 与放射性标记的阳性对照 cDNA 杂交。
筛选得到的 cDNA 产生的杂交信号应比随机引发制备的 cDNA(步骤 4) 产生的杂交信号约强 1000 倍以上。
21.—旦阳性对照的富集得到证实，大量扩增以制备至少 1.5ug 的筛选得到的 cDNA。
用酚: 氯仿抽提反应产物，并用标准的乙醇法沉淀 DNA。沉淀干燥后重溶于 7.5ulTE 中（200ug/ml)。
cDNA 直接筛选（第二轮筛选)
按照第一轮筛选的条件进行，使用的 cDNA 是 1ug 第一轮筛选产物，基因组靶标 DNA 用量为 50ng(此例中全长为 500kb)。
22. 按步骤 9 的描述封闭第一轮所筛选 cDNA 中的重复序列（用 1ug 第一轮筛选产物并保留 0.5ug 供后续分析)。
23. 按步骤 9 至 13 进行第二轮筛选。
24. 按步骤 18 用 1% 琼脂糖凝胶电泳分析第二轮筛选扩增产物，在另一个泳道上样保留的 0.5ug 第一轮筛选 cDNA 产物，同时上样 0.5 初始 cDNA。
25. 按步骤 20 用放射性标记的报道探针进行 Southern 印迹分析。
通常此次分析结果将显示, 从初始 cDNA 到第一轮筛选 cDNA 报道探针的丰度得到极大的提髙，而从第一轮筛选 cDNA 到第二轮筛选 cDNA 报道探针的丰度将得到相对适度的提高（约 10 倍）。
26.—旦阳性对照的富集得到证实，将筛选得到克隆到合适的载体中去。扩增接头盒上带有的限制位点有利于将第二轮筛选得到的 cDNA 克隆人噬菌体或质粒载体中。
一个很有用的选择是使用一种现已商品化的不依赖连接的克隆系统（例如 Life Technologies 公司的 UDG 系统或者 CLONEAMP 公司 pAMP 载体系统)。如使用这些系统之一，则使用 5'经过廷伸修饰的 oligo3 引物 (细则参见生产厂家）。关于这一策略的深入讨论，参见信息栏「不依赖于连接的克隆」。
缓冲液与溶液
10x 扩增缓冲液
缓冲液中含有 0.01%(m/V) 的明胶
ATP(10 mmol/L)
2X 杂交液
1.5mol/L NaCl
40 mmol/L 磷酸钠缓冲液（pH7.2)
10 mmol/L EDTA(pH6.0)
10xDehardt’s 液
0.2%SDS
NaOH(0.lmol/L)
1X 缺口平移缓冲液
500 mmol/LTris-HCl(pH7.5)
100 mmol/LMgCl2
50 mmol/LDTT
SDS(10%)
20XSSC
链霉亲和素-磁珠结合缓冲液
10 mmol/LTris-HCl(pH7.5)
1 mmol/LEDTA(pH8.0)
1mol/LNaCl
Tris-HCl(lmol/L,pH7.5)
酶及缓冲液
DNA 聚合酶/DNaseI(5 单位/ul;Boehringer Mannheim 公司）
限制性内切核酸酶
T4DNA 连接酶
热稳定 DNA 聚合酶
凝胶
琼脂糖凝胶（1%),0.5XTBE 配制
见步骤 18.19,24 和 25
核酸与寡核苷酸
含有靶标基因组 DNA 区域的 BACDNA
纯化方法见第 4 章方案 8 或 9。
随机引发制备的平末端 cDNA
见方案 1 阶段 1。
Cot1 基因组 DNA
胞浆 poly(A)+RNA, 纯化自研究对象组织或细胞系
见方案 1 阶段 1。
DNA 分子质量标志物
dNTP 溶液，每种 dNTP 浓度 0.4 mmol/L(pH8.0), 用于缺口平移标记实验
dNTP 溶液，每种 dNTP 浓度 2.5 mmol/L(pH8.0)，用于 PCR 扩增
寡核苷酸 [10 mmol/L,TE(pH8.0) 配制]
阳性对照 DNA
阳性对照 DNA 须是已知存在于初始基因组 DNA 中的基因或表达序列标签（EST）的一部分。如没有已知基因，则在标记之前在基因组 DNA 中（按 1:1 分于比例）加入一段单拷贝对照 DNA，闻时在 cDNA 样品中加人对照 DNA, 使对照 DNA 与 cDNA 的分子比例为 1:106。应用第 9 章给出的方案之一标记 DNA 样品；标记方案的选择取决于实验目的（关于选择的讨论，参见第 9 章的导言）。
标记化合物
[a-32P]dCTP(3000Ci/mmol)
Biotin16-dUTP(0.4 mmol)
考用设备
带滤芯的自动加样尖头
盖革计数器或切伦科夫计数器
预设溫度为 14°C 和 100°C 的加热装置
带旋转轴的杂交炉，或振荡水浴
分离链霉亲和素磁珠的磁性分离装置
微量离心管（PCR 扩增用 0.5 ml 薄壁管）
带退尖头装置的自动加样器
SephadexG-50 离心柱，用 TE(pH7.6) 平衡
Steptavidin 包被的顺磁珠
可按预设扩增方案进行的热循环仪
如热循环仪不带热盖, 则须使用矿物油或封口石蜡以减少 PCR 时反应混合物的液体蒸发，使用封口石蜡不仅可以防止蒸发，还可在反应馄合物加热之前保持组分（例如引物和模板）分离，这有助于防止在反应的初始阶段引物的非特异结合（见第 8 章信息栏"热启动 PCR")。
预设溫度为 65°C 的水浴
附加试剂
本方案步骤 1 所需的试剂列在第 10 章，方案 2。
本方案步骤 2 所需的用于随机引物起始双链 cDNA 合成或用于从 cDNA 文库中扩增插入片段的试剂列在方案 1, 阶段 1 和 2。
本方案步骤 2 标记所需的试剂列在第 9 章，方案 3、5 和 6。
本方案步骤 19 和 20 所需的试剂列在第 6 章，方案 8 和 10。
方法
带接头的 cDNA 库的制备
1. 按照第 10 章方案 2, 用多聚核苷酸激酶分别对 Ooligo3 和 oligo4 的 5'末端磷酸化进行标记，将标记的两种互补的寡核苷酸按等分子比例混合（每种约 2ug)，100°C 变性 10 min, 缓慢冷至室温。这一过程中，两种寡核苷酸复性形成衔接子。将衔接子的浓度调整为 1ug/ml。
2. 以胞浆 poly(A)RNA 为材料，利用随机引发制备至少 2ug 的平末端双链 cDNA(见方案 l)。
3. 在一个无菌的 0.5 ml 微量离心管中配置以下连接反应体系：
双链平末端 cDNA(步骤 2) 2ug
寡核苷酸扩增盒混合物 3ul
(1ug/ul，来自步骤 1)
10XT4DNA 连接酶缓冲液 3ul
10 mmol/LATP 3ul
T4DNA 连接酶 (1 单位/ul) 3ul
加 H2O 至 30ul
14°C 温育 16 h。在 65°C 放置 10 min 灭活 T4DNA 连接酶。
10x 连接反应缓冲液组分已添加 ATP, 则反应混合物中可加入更大体积的载体或外源 DNA。使用商品化的含 ATP 的连接缓冲液，则无须添加 ATP。
4. 用酚: 氯仿抽提连接反应产物，结合 SephadexG-50 离心柱层析对产物进行纯化并用常规的乙醇法沉淀 DNA。沉淀干燥后重溶于 10ulTE(pH7.6)。
基因组 DNA 克隆的生物素标记
5. 利用缺口平移法在 BAC 基因组 DNA 克隆中引入生物素化的碱基。在一个无菌的 0.5 ml 微量离心管中配置以下缺口平移反应体系（对每个 BAC 基因组 DNA 分别标记):
纯化的 BAC DNA(0.1 mg/ml) 1ul
生物素-16-dUTP(0.04 mmol/L) 1ul
10x 缺口平移缓冲液 2ul
用于缺口平移的 dNTP 溶液（0.4 mmol/L) 1ul
[a-32P]dCTP(3000Ci/mmol) 1ul
DNA 聚合酶/DNaseI(5 单位/ul) 1ul
加 H2O 至 20ul
4°C 反应 2 h。
6. 对用缺口平移法进行放射性与生物素标记的产物用 Sephadex G-50 离心柱层析进行纯化，并用常规的乙醇法沉淀 DNA。沉淀重溶于 10ulTE 并-20°C 保存。
链霉亲和素磁珠的制备
7. 在一个无菌的 1.5 ml 小离心管中，用 500ul 链霉亲和素-磁珠结合缓冲液洗涤 3 mg(300ul) 磁珠三次。每次洗涤后用磁性分离装置将磁珠从结合缓冲液中取出。洗涤后磁珠重悬于链霉亲和素-磁珠结合缓冲液，浓度为 10 mg/ml。
8. 对每一标记反应都取少量产物（步骤 6) 检测其结合链霉亲和素包被的磁珠的能力。
在一个无菌的 0.5 ml 微量离心管中配置以下结合反应体系
洗涤后的链霉亲和素包被的磁珠（步骤 7) 20ul
标记的基因组 DNA 连续片段（步骤 6) 1ul
链霉亲和素-磁珠结合缓冲液 29ul
~undefined将叠连群上分别标记的每个 BAC DNA 等量混合，混合物浓度为10ng/ul。
室温温育 15 min, 中间不时温和混匀。用磁性分离装置分离磁珠，转移上清至一个无菌的 0.5 ml 微量离心管中。用盖革计数器或切伦科夫计数器检测磁珠和上清中的放射性活度。如结合的同位素与游离的同位素比例大于 8:1, 则进行直接筛选。
如结合的同位素与游离的同位素比例小于 8∶1, 可能表明步骤 5 中的 DNA 不适合标记。可在进行标记前, 对 BACDNA 再次用酚: 氯仿反复抽提并通过 SephadexG-50 离心柱层析纯化。
直接筛选（第一轮筛选）
9. 按以下步骤用 C0tlDNA 封闭或 “重复抑制” cDNA 库（来自步骤 4) 中的重复序列：
a. 在一个无菌的 0.5 ml 微量离心管中配置以下复性反应体系：
带接头的 cDNA(步骤 4) 5ul(1ug）
人基因组 C0tlDNA 5ul(1ug）
b. 在反应混合物上方加入低比重矿物油（约 50ul) 防止蒸发，然后 100°C 变性 10 min。冷却反应体系至 65°C, 向矿物池下加入 10ul 的 2X 杂交液。海和混匀后 65°C 温育 4 h。
如使用的为 YAC 基因组 DNA 靶标，则 DNA 可能为宿主（酵母）核糖体序列所污染。至少用 100ng 来源于 rRNA 的 cDNA 封闭这些序列（见本方案结尾疑难解答)。
10. 当 cDNA 库与 C0tlDNA 的杂交完成后，进行第一轮直接筛选。取 5ul(50ng) 来自步骤 6 中生物素标记的 BAC DNA 加在一个新的 0.5 ml 量微量离心管中，在反应液的上方覆盖一滴矿物油（约 50ul) 防止蒸发。100°C 变性 BAC DNA10 min 后，冷却反应体系至 65°C。
11. 在无菌的 0.5 ml 微量离心管中配置以下复性反应体系：
生物素际记的 BAC DNA(来自步骤 10) 5ul(50ng)
封闭后的 cDNA(来自步骤 9,1ug 20ul
cDNA 加 1ug C0tlDNA)
2x 杂交液 5ul
温和混勻，旋转杂交炉或振荡水裕 65°C 温育 54 h 以上。
12. 为进行基因组 DNA 与 cDNA 杂合体的捕获与洗涤，在无菌的 1.5 ml 微量离心管中加入以下试剂：
洗涤后的链霉亲和素包被的磁珠 100ul
复性反应混合物（来自步骤 11) 30ul
链霉亲和素-磁珠结合缓冲液 100ul
室温温育 15 min, 中间偶尔温和混匀。用磁性分离装置吸附磁珠，然后移除上淸。
用 1 ml1xSSC/0.1%SDS 在室温洗涤磁珠两次，每次 15 min; 然后用 1 ml 0.1xSSC/0.1%SDS 在 65°C 洗涤磁珠三次，每次 15 min。最后一次洗涤后，将磁珠转移至一新的微量离心管中。
13. 将步骤 12 中杂交在磁珠上的 cDNA 洗脱下来：
a. 加入 100ul 的 0.1mol/LNaOH, 室温放置 10 min。
b. 加入 100 的 1ml/L Tris-HCl(pH7.5)
c. 将反应混合物通过 Sephadex G-50 离心柱层析进行脱盐（见附录 8)
第一轮筛选得到的 cDNA 的扩增
14. 从洗脱下来的 200ul 的 cDNA(步骤 13) 中取三份（1ul、5ul 和 10ul) 分别加入无菌的 0.5 mlPCR 管中。
15. 在每管中各加入以下试剂：
引物 oligo3(10 mmol/L) 5ul
10XPCR 缓冲液 2.5ul
dNTP 溶液（每种 2.5 mmol/L)，PCR 用 2.5ul
Taq DNA 聚合酶（Perkin Elmer 公司，5 单位 ul) 0.2ul
加水至 25ul
按上述配置同时设置两个对照实验。阴性对照管加入上述所有试剂，但省略 cDNA 模板。第二个对照中则加入 10ng 初始 cDNA(步骤 4) 作为模板。
16. 如热循环仪不带热盖，则在反应混合物上方覆盖一滴（约 50ul) 低比重矿物油以防止蒸发。或者加入石蜡珠以应用热启动 PCR。将 PCR 管置于热循环仪上。
17. 按下表列出的变性、复性和延伸参数进行扩增反应。
18. 用 1% 琼脂糖凝胶在 0.5XTBE 电泳缓冲液中电泳分析每管中 10% 的 PCR 产物，加入适当大小的 DNA 分子质量标准。用溴化乙啶或 SYBR GOLD 染胶以显示 DNA, 估计 cDNA 扩增产物的浓度，确定能产生最大置扩增产物应加入的模板 cDNA 浓度。
成功反应的产物可见弥散的 cDNA 扩增片段, 可能带有一些清晰的条带。
19. 从每管中取等量扩增产物（每泳道约 0.5ug) 加在第 2 块 1% 琼脂糖凝胶上，同样加入适当大小的 DNA 分子质量标准。同时上样 0.5 步骤 4 中随机引发所制备的 cDNA。
20. 将分离开的 DNA 转移到膜上，通过 Southrn 印迹（第 6 章方案 8) 与放射性标记的阳性对照 cDNA 杂交。
筛选得到的 cDNA 产生的杂交信号应比随机引发制备的 cDNA(步骤 4) 产生的杂交信号约强 1000 倍以上。
21.—旦阳性对照的富集得到证实，大量扩增以制备至少 1.5ug 的筛选得到的 cDNA。
用酚: 氯仿抽提反应产物，并用标准的乙醇法沉淀 DNA。沉淀干燥后重溶于 7.5ulTE 中（200ug/ml)。
cDNA 直接筛选（第二轮筛选)
按照第一轮筛选的条件进行，使用的 cDNA 是 1ug 第一轮筛选产物，基因组靶标 DNA 用量为 50ng(此例中全长为 500kb)。
22. 按步骤 9 的描述封闭第一轮所筛选 cDNA 中的重复序列（用 1ug 第一轮筛选产物并保留 0.5ug 供后续分析)。
23. 按步骤 9 至 13 进行第二轮筛选。
24. 按步骤 18 用 1% 琼脂糖凝胶电泳分析第二轮筛选扩增产物，在另一个泳道上样保留的 0.5ug 第一轮筛选 cDNA 产物，同时上样 0.5 初始 cDNA。
25. 按步骤 20 用放射性标记的报道探针进行 Southern 印迹分析。
通常此次分析结果将显示, 从初始 cDNA 到第一轮筛选 cDNA 报道探针的丰度得到极大的提髙，而从第一轮筛选 cDNA 到第二轮筛选 cDNA 报道探针的丰度将得到相对适度的提高（约 10 倍）。
26.—旦阳性对照的富集得到证实，将筛选得到克隆到合适的载体中去。扩增接头盒上带有的限制位点有利于将第二轮筛选得到的 cDNA 克隆人噬菌体或质粒载体中。
一个很有用的选择是使用一种现已商品化的不依赖连接的克隆系统（例如 Life Technologies 公司的 UDG 系统或者 CLONEAMP 公司 pAMP 载体系统)。如使用这些系统之一，则使用 5'经过廷伸修饰的 oligo3 引物 (细则参见生产厂家）。关于这一策略的深入讨论，参见信息栏「不依赖于连接的克隆」。
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