Northern-Blotting杂交技术的实验原理与实验方法

探针的原理及其应用 Northern Blotting技术专题

Northern 杂交是RNA定量测定的一种检测方法，主要利用碱基配对原则，利用特性的DNA探针 与其杂交，经过显影技术分析RNA的量和大小。

Northern 杂交的原理

Northern 杂交是用来测量真核生物RNA的量和大小估计其丰度的实验方法，可以从大量的RNA样本同时获得这些信息。其基本步骤包括：

1. 完整mRNA的分离

2. 根据RNA的大小通过琼脂 糖凝胶电泳对RNA进行分离

3. 将RNA 转移到固相支持物上，在转移的过程中，要保持RNA 在凝胶中的相对分布

4. 将RNA固定到支持物上

5. 固相RNA与探针分子 杂交

6. 除去非特异结合到固相支持物上的探针分子

7. 对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析

Northern 杂交的实验方法

[仪器、试剂、材料]

(一)仪器

恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉(或微波炉)，离心管，烧杯，量筒，三角瓶，等。

(二)材料

总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜

(三)试剂

NorthernMax Kit(Cat. # 1940，Ambion, Inc.)，琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer， dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双氧水, 灭菌水等。

[方法与步骤]

1. 用具的准备：

180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。

电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。

处理DEPC水(2 L)备用。

2.用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染

用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。

3.制胶：

1. 称取0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60℃空气浴平衡溶液 (需加DEPC水补充蒸发的水分)

2. 在通风厨中加入3.6ml的10*Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。

注意尽量避免产生气泡。

3. 将熔胶倒入制胶板中，插上梳子

如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘。注：胶的厚度不能超过0.5cm。

4.胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer盖过胶面约1cm，小心拔出梳子。(配制250ml　1*MOPS Gel Running buffer，在电泳过程中补充蒸发的buffer。)

5.检查点样孔。

4. RNA样品的制备

在RNA样品中加入3倍体积的formaldehyde load dye和适当的EB(终浓度为10ug/ml)。混匀后，65℃空气浴15min。短暂低速离心后，立即放置于冰上5min。

5. 电泳：

1. 将RNA样品小心加到点样孔中。

2. 在5V/cm下跑胶(5x14cm)。在电泳过程中，每隔30min短暂停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴纷蓝(500bp)接近胶的边缘时终止电泳。

3. 紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。

注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。

6. 转膜

1.用3%双氧水浸泡真空转移仪后，用DEPC水冲洗。

2.用RNAZap擦洗多孔渗水屏和塑胶屏，用DEPC水冲洗二次。

3.连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小的膜(膜的四边缘应大于塑胶屏孔口的5mm)，膜在Transfer buffer浸湿5分钟后，放置在多孔渗水屏的适当位置。

4.盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁。

5.将胶的多余部分切除，切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔，并至少盖过边缘约2mm，以防止漏气。

6.将胶小心放置在膜的上面，膜与胶之间不能有气泡。

7.打开真空泵，使压强维持在50~58mbar;立即将transfer buffer加到胶面和四周。每隔10min在胶面加上1ml transfer buffer，真空转移2小时。

8.转膜后，用镊子夹住膜，于1x MOPS Gel Running buffer中轻轻泡洗10秒，去除残余的胶和盐。

9.用吸水纸吸取膜上多余的液体后，将膜置于UV交联仪中自动交联。

10.将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测转移效率。(避免太长的紫外曝光时间)

12.将膜在-20℃保存。

7. 探针的制备

1.在1.5ml离心管中配制以下反应液：

模板DNA(25 ng) 　　　　1ul

Random Primer 2ul

灭菌水 11ul

总体积：14ul

2.95°C加热3分钟后，迅速放置于冰冷却5min。

3.在离心管中按下列顺序加入以下溶液：

10×Buffer 2.5ul

dNTP Mixture 2.5ul

111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 ul

Exo-free Klenow Fragment 1 ul

4.混匀后(25ul)，37°C下反应30分钟。短暂离心，收集溶液到管底。

5.65°C加热5min使酶失活。

8. 探针的纯化及比活性测定：

1.准备凝胶：将1g凝胶加入30ml的DEPC水中，浸泡过夜。用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次，以除去可溶解的葡聚糖。换用新配制的TE(PH7.6)。

2.取1ml一次性注射器，去除内芯推扞，将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住，在注射器中装填Sephadex G-50凝胶。

3.将注射器放入一支15ml离心管中，注射器把手架在离心管口上。1600g离心4分钟，凝胶压紧后，补加Sephadex G-50凝胶悬液，重复此步直至凝胶柱高度达注射器0.9ml刻度处

4.100ul STE缓冲液洗柱，1600g离心4min。重复3次。

5.倒掉离心管中的溶液后，将一去盖的1.5ml离心管置于管中，再将装填了Sephadex G-50凝胶的注射器插入离心管中，注射器口对准1.5ml离心管。

6.将标记的DNA样品加入25 ul STE，取出0.5ul点样于DE8　paper上，其余上样于层析柱上。

7.1600g离心4min，DNA将流出被收集在去盖的离心管中，而未掺入DNA的dNTP则保留在层析柱中。取0.5ul己纯化的探针点样于DE8-paper.

8. 测比活性(试剂比活要求:106cpm/ml)。

9.预杂交：

1.将预杂交液在杂交炉中68℃预热，并漩涡使未溶解的物质溶解。

2.加入适当的ULRAhyb到杂交管中(以100cm2 膜面积加入10mlULRAhyb杂交液)，42℃预杂交4 hr。

10.探针变性：

1.用10 mM EDTA将探针稀释10倍。

2.90℃热处理稀释后探针10min后，立即放置于冰上5min。

3.短暂离心，将溶液收集到管底。

11.杂交：

1.加入0.5ml ULTRAhyb到变性的探针中，混匀后，将探针加到预杂交液中。

2.42℃杂交过夜(14~24hr)。

杂交完后，将杂交液收集起来于-20℃保存。

12.洗膜：

1.低严紧性洗膜：加入Low Stringency Wash Solution#1 (100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液)，室温下，摇动洗膜5min两次。

2.高严紧性洗膜： 加入High Stringency Wash Solution#2 (100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液)，42℃ 摇动洗膜20min两次。

13.曝光：

1. 将膜从洗膜液中取出，用保鲜膜包住，以防止膜干燥。

2. 检查膜上放射性强度，估计曝光时间

3. 将X光底片覆盖与膜上，曝光

4. 冲洗X光底片，扫描记录结果。

14.去除膜上的探针：将200ml　0.1%SDS(由DEPC水配制)煮沸后，将膜放入，室温下让SDS冷却到室温，取出膜，去除多余的液体，干燥后，可以保存几个月。

15.杂交结果

操作注意事项：Northern 杂交所用到的仪器和实验试剂必须均用RNAse 酶处理避免RNA样品的降解。二、转膜时膜和胶之间不能存在气泡。