SDS-PAGE后考染和脱色的方法及注意问题

      花了点时间整理了园内有关考染的帖子，拿出来共享，希望对刚动手做WB的战友有所帮助。

      12.5％考马斯亮蓝染色液的配制（含30％甲醇，10％乙酸）
      考马斯亮蓝R250 0.125g
      甲醇 30ml
      冰乙酸 10ml
      加ddH2O至 100ml
      染胶1h~2h
      脱色液配制（含30％甲醇，10％乙酸）
      甲醇 30ml
      冰乙酸 10ml
      加dd H2O至 100ml
注：1. 染色液可回收利用；室温保存即可；甲醇可以用乙醇代替。
       2.其它脱色液：
（1）用水脱色，但效果非常不好，建议不要用。
（2）脱色液也可以用0.5％mol/l的氯化钠，没有气味，脱色效果也不错。但胶可能会胀的厉害!
（3） 20%的甲醇和0.1M的tis-磷酸（PH6.5）
先用tis-磷酸（PH6。5）漂洗2min，然后用20%的甲醇漂洗1min（最好不要超过1min），最后用20%的NH4SO4固定30min
       3. dd H2O煮法脱色
PAGE胶染色完毕后，如果用一般的甲醇－乙酸脱色液进行脱色，一般至少需要2－3h，可利用蒸馏水煮的方法：
（1）. 先将500ml蒸馏水放在一个干净的烧杯中，在电炉上煮沸。
（2）. 将染色好的胶用DD水冲净后放入煮沸的蒸馏水中，煮3～5min。
（3）. 将DD水倒掉，看胶是否已经脱净，如果还不好，可以用少量水再煮一次。
一般整个脱色过程最多15min即可搞定！还可以避免每次脱色时的醋酸味！
      4. 重复利用
（1） 染色液和脱色液重复次数不一定的,可以根据他们的着染能力和脱色能力考虑是否换新的.夏季甲醇挥发快,用3~5次应该可以用.当然,用时要加盖.
（2）脱色时注意防止挥发,脱色液可以用活性碳处理后反复用多次的.
（3）脱色液反复使用，用两三次后用活性炭“包被”的滤纸过滤，滤纸可反复使用。脱色液反复使用后，胶有点泛红，但不影响观察，如果要发表，建议用新配脱色液。
      5. 加快染色和脱色速度
（1）染色和脱色都可以在微波炉中加热甚至煮沸，很省时间。但注意不要沸腾时间太长，否则容易把胶上煮出泡状的破损。
（2）若为了提高考染及脱色速度，可在45℃左右的水浴中进行，染色时间只需几分钟（其间轻轻晃动一二次，整个胶变为较深的亮兰色即可）。脱色也在水浴中（约需15分钟），
（3）胶放入用乙醇-乙酸配成的脱色液后微波加热10秒钟至微热,上摇床,10分钟后,倒掉,换新的脱色液重复一次,不超过半个小时也好了.
（4）用乙醇和乙酸配脱色液,然后加热脱色，很快的，可加热到马上要沸腾为止。不但脱色可以，染色也可加热，速度也很快
（5）用蒸馏水洗胶，并放在微波炉里加热，效果很好。
只是要掌握好时间，时间太长而蛋白的含量又比较低的话，容易脱过了！
（6）加入甲醇－乙酸脱色液后，将其直接放到微波炉里加热一分钟，然后放几张干净的tissue进去（把它叠成条状，沾在脱色皿边上就OK啦!(不要和胶混在一起）)，能吸去很多染料，加快脱色，效果不错。
      6. 注意问题
（1）胶脱色不能脱的太久，虽然越脱越清楚，但脱的太久了，弱带就看不见了，胶也会变的失真，这样的胶照出的照片是很难被接受的。如果样品条带或点不是很浓，就不可以脱太久。但如果要拍照，最起码要保证底色脱完全，要不然照片效果也不会好的。
（2）如果需要长时间脱色，注意要换脱色液,且量要足够,否则甲醇挥发很快,胶容易干卷.把本底脱干净后可以把胶放水中保存.半个月应该没问题；《分子克隆》：长期保存可以在水中加20%的甘油。也有站友经验：考染不能长时间保存，尤其是在水里，3天颜色就会溶到水里。具体情况要自己摸索了。

       7. 胶一般应放20%的甘油中长久保存（见“分子克隆”）