蛋白质的定量法与标准曲线的制备

Western Blot技术专题 LOWRY法蛋白定量专题

A. Folin-phenol(lowry method)定量法

此法以Biuret方法反应为基础发展而起，因此会严重干扰Biuret测定方法的因子都会影响此测定法的准确度。这些干扰因子包括：含-CS-NH2，-CH2-NH2，-CRH-NH2，-CH2-NH-CHNH2-CH2OH，-CHOH-CH2NH2等基团的物质以及缓冲剂如Tris、蔗糖、低浓度的酚类、柠檬酸等，但低浓度的尿素、硫酸胺可以增加碳酸钠-氢氧化钠的浓度来校正显色结果。1951年Lowry对于 Folin-Ciocalteu 试剂在不同的 pH值条件下得到此试剂作用的最佳反应条件，此法的灵敏度较Biuret方法高约100倍，反应时间只要约15分钟即可显色，颜色的稳定度可达数小时，故目前多用Folin-phenol法测定待测样本的蛋白质浓度。

原理：蛋白质与Folin试剂作用分成两个阶段：

1.蛋白质 先与碱性铜离子作用

Cu2+ + Protein- Cu-Protein

当碱性的铜离子试剂和蛋白质中的 peptide bond反应时会产生biuret test 的初步呈色反应，此蛋白质铜复合物会再由Phosphomolybdic-phosphotungstic试剂(Folin-Ciocalteu Reagent)作用形成蓝色物质。

蛋白质分子 中可和Folin – Ciocalteu 试剂作用的团基有：Histidine的Imidazole Group、Tyrosine的Phenolic Hydroxyl Group、Cysteine的Sulfhdryl Group、Arginine的Guanidino Group。在这些团基中，Tyrosine的Phenolic Hydroxyl Group最为重要，碱性蛋白质与Folin-Ciocalteu Reagent复合物的颜色强度与蛋白质中的芳香族官能基 (aromatic group) 成正比。

值得注意的是当Folin-Ciocalteu 试剂在强碱的环境中易使 phosphomolybdate解离而丧失作用的能力，所以此剂须新鲜配制并避免与蛋白质中的 Tyrosine 及 Tryptophan 反应前置于强碱的环境中，依比色的方法测其吸亮度，换算蛋白质的量。

* 注意

Folin-Ciocateu phenol 试剂在酸性环境中才稳定，但 Lowry method 必须在 pH=10 才会发生，所以 Folin - Ciocalteu Reagent 一加入碱性的硫酸铜-蛋白质溶液中(alkaline cooper protein )必须马上混合均匀，以确保还原反应在phosphomolybdic- phosphotungstate 分解之前发生。

以上两种蛋白质显色定量法均会破坏样本中的蛋白质，故当蛋白质样本量少又需要回收时，不可以使用此种方法定量。

B.紫外线吸收值测定法

由于蛋白质分子 中多含有芳香族胺基酸(如苯丙胺酸(phenylalanine)、色胺酸(tryptophan)、酪胺酸(tyrosine) )残基，这些残基含有具共轭电子的苯环团基，故在紫外线波长280nm、260nm会有吸光值。在波长280nm之吸光值与蛋白质的浓度具正相关性，故可以利用280nm的吸光值做为蛋白质的定量工具。此法的优点是迅速、简便，不消耗样品及不受低浓度的盐类干扰。但此种测定方法的缺点是，许多其它物质在此波长附近亦有吸光现象，如核酸虽在260nm会有最大吸光值，但在280nm处仍会有吸光的现象。一般而言，纯的蛋白质之280nm/260nm比值约1.75，但此数值会依蛋白质含方香族胺基酸含量而变，因此利用此方法测定蛋白质的浓度最大的缺点是，对于测定那些与标准蛋白质中色胺酸(tryptophan)、酪胺酸(tyrosine)含量差别大的蛋白质，测定的浓度会有一定的误差;再者，样品中如果又含有核酸等吸光物质时亦会出现大的干扰。因此待测样本或标准液在作适当的稀释并在波长280nm及260nm测得吸光值后，可以利用下列的公式以校正蛋白质的浓度。

公式：

蛋白值浓度(mg/ml) = 1.45A280 - 0.75A260

Folin-phenol(lowry method)定量法

A. 试剂与仪器：

溶于

1. reagent A：100g NaCO3 1L 0.5N NaOH 。

溶于

2. reagent B： 1g CuSO4‧5H2O 100mL ddH2O。

溶于

3. reagent C： 2g NaKC4O6‧4H2O 200mL ddH2O。

此三溶液分别储存。

4. bovine serum albumin solution 300 ug/mL ( W/V)

5. 平口试管13支

6. 试管振荡器

7. Spectronic 20光电比色计

8. 安全吸球

9. 玻璃刻度吸管

10. 微量吸管辅助器

B. Lowry method 操作步骤：

1. 将 Spectrophotometer 温机。

2. 取 bovine serum albumin solution 0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1mL 及未知蛋白质样本 1mL 置于已标好的试管中。

3. 在上步骤的试管中加入蒸馏水使试管中的体积为 1mL 。

*此时取 15mL 的 reagent A 与 0.75mL reagent B 及 0.75mL reagent C 混合均匀成为 reagent D。

4. 取 1mL reagent D 加入步骤 3 之各试管中，马上以试管振荡器混合均匀。

5. 将混合液置于室温 15 分钟。

*此时取 5.0mL 2N Folin-phenol reagent 加入 45mL ddH2O，混合均匀。

6. 取 3mL 稀释的 Folin-phenol reagent 加入步骤 5 之试管中，马上以试管振荡器混合均匀。

7. 将混合液置于室温 45 分钟。

* 呈色后之产物 45~60 分钟颜色稳定。

8. 在波长 540nm 及 750nm 下分别测其吸光值。

9. 分别以 A540、A750 浓度 ug/mL 作表、作图。求得线性回归方程式，并由方程式求出未知蛋白质的浓度。

还原糖标准曲线的制备与a-amylase 活性测定

还原糖的定量测定与糖浓度标准曲线的测定：

3,5-dinitrosalicylic acid定量法

利用葡萄糖作为还原糖的单位：

以3,5-dinitrosalicylic acid法碱性的环境下会被还原成3-amino-5- nitrosalicylic acid，来检测还原糖的存在。

材料与仪器：

1. 3,5-dinitrosalicylic acid (DNSA) 试剂(此药剂必须新鲜配制)：

配制法：

(1). 先将Sodium potassium tartrate 300g溶于500ml的蒸馏水中。

(2). 取 3,5-dinitrosalicylic acid 10g溶于200ml 2M的NaOH溶液中。

(3). 将(2)之碱性3,5-dinitrosaliylic acid溶液慢慢加入(1)之溶液中。加蒸馏水至 体积1000ml。

2. 1M NaOH

3. 1000mM之glucose。

4. 试管震荡器

5. 螺旋试管20支

6. 试管架

7. 水浴槽

8. 安全吸球

9. 玻璃刻度吸管

10. 光电比色计

步骤：

A.

1. 取不同糖试液3ml置于螺旋试管中。(如表一)

2. 加入DNSA试剂1ml，混合均匀。

3. 在95OC水浴中加热3分钟。

4. 取出试管冷却，观察其颜色变化。

5. 用光电比色计测波长540nm下之吸光值。

6. 反应之废液倒入指定的废液筒。

表一：依下表配制不同浓度的glucose溶液：

☆ 算出glucose mmole与540nm下吸光值之线性回归方程式。

a-amylase 活性测定

材料：

1. 0.1M Na,K-phosphate buffer pH=6.7 ( 0.1M Na2HPO4 与 0.1M KH2PO4 以43.5：6.5(V/V)混合即可。

2. 0.01%、0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%.、0.5%、1%、2% Glycogen溶于内含0.01% NaCl的0.1M Na,K-phosphate buffer中。

3. 2N NaOH(停止反应)。

4. 60% Na,K-tartrate。

5. 1% dinitrosalicyclic acid 溶液(DNSA)。

6. 5U/ml a-amylase溶液。

注：

1. 0.5% Glycogen基质之配制。

5克Glycogen溶于500ml蒸馏水，搅拌均匀加缓冲液加至体积一升。(Glycogen溶解速度慢需于实验前配制好)

2. DNSA之配制：

5%之3,5-dinitrosalicyclic acid(溶于2N NaOH)以水作5倍稀释或以60% Na,K-tartrate溶液作 2：5(V/V)稀释及即可。

步骤：

1. 取Glycogen基质3ml置于 25oC 水浴槽中预热3分钟。(可在室温操作)。

2. 取出加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μl a-amylase溶液(或是纯化步骤中稀释之收集液)加入各管，混合均匀后置于25oC 水浴槽3分钟。(酵素液应储放于冰上)

3. 将反应液取出加入 1N NaOH 1ml后加以混合以停止酵素反应。

4. 待最后一管完成后，全部之反应的试管加入 1ml DNSA，混合均匀。

5. 将试管置95OC 3分钟，冷却之至室温后，在 540nm 读取吸光值。

☆ 计算a-amylase之活性单位：

☆ 酵素的活性单位表示法

表二：酵素活性单位(unit of enzyme activity)的表示