SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白大小与纯度的鉴定

原理

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acrylamide简称Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（N，Nˊ-MethyleneBisacrylamide,简称Bis）,在催化剂核黄素或过硫酸铵和四甲基乙二胺的催化下，聚和而成的具有三维网状结构的胶。

正常情况下蛋白的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。而在丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(SDS)，则蛋白的迁移率主要取决于蛋白大小，与所带电荷与形状无关。因此可以利用SDS-PAGE对蛋白质分子量与纯度进行鉴定。

试剂

1、A溶液：1.5M Tris（三氨基甲烷），0.4%SDS，pH8.8。

2、B溶液：0.5M Tris.Cl，0.4%SDS，pH6.8。

3、5×ESB（加样缓冲液）。

4、染色液：0.25%的考马斯亮蓝R 250、40%的甲醇、10%的乙酸。

5、脱色液：40%的甲醇、10%的乙酸。

6、10×Laemmle-buffer（电极缓冲液）：250mMTris、1920mM甘氨酸、1%SDS。

7、10%过硫酸铵（APS）

8、 异丙醇

9、 四甲基乙二胺（TEMED）

制胶

根据蛋白样品的大小制不同浓度的胶，蛋白分子量小就要制高浓度的胶，分子量大的蛋白就制低浓度的胶，制不同厚度的胶所需的浓缩胶和分离胶体积也不一样。5%浓缩胶：

30%Acr-Bis 1ml、A溶液1.5ml、无菌水3.5 ml、APS 75ul、TEMED 10ul。

12.5%分离胶：

30%Acr-Bis 5 ml、B溶液3 ml、无菌水3.9 ml、APS 150ul、TEMED 10ul。

加样、电泳

过稍许时间等胶凝固后把蛋白marker和所需的鉴定的蛋白经处理后加到加样孔中，倒入电泳缓冲液接通电源开始跑胶。

染色、脱色

等示踪染料溴酚蓝进入行至胶末端，关闭电源，去除浓缩胶后，将分离胶放入考马斯亮蓝染色液中染色40分钟，然后放入脱色液中脱色1小时，并换脱色液2-3次。

节省时间小窍门

正常情况下胶跑完之后要染色脱色3-4个小时之后才能看到结果，如果我们把染色液加热一下染色这样就会加快染色，或者是把染色中考马斯亮蓝R 250加倍10-20分钟就可以。脱色的时候我们可以不用脱色液，直接在水中煮沸10分钟就能看到结果，如果不够清楚，可以换水再煮10分钟。