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聚丙烯酰胺凝胶(PAGE胶电泳)电泳的方法与银染方法

2024-04-17 蛋白质技术加入收藏

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PAGE胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳）主要是以PAGE为介质，根据DNA分子大小和电荷分离DNA分子。PAGE胶电泳采用银染法进行显色。银染的原理：一、银离子（一般是AgNO3 )和DNA结合;二、还原剂甲醛把Ag+ 还原成银颗粒，最终DNA呈现为黑褐色。

聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析，其装载的样品量大，回收DNA纯度高，长度仅相差0.1%(即1000bp中的1bp)的核苷酸分子即能分离。

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N'一四甲基乙二胺)和过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N'一亚甲双丙烯酰胺(交联剂)参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶。聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺和交联剂的浓度及比例决定的，不同浓度丙烯酰胺和DNA的有效分离范围见下表.

丙烯酰胺(%) 有效分离范围(bp) 溴酚兰* 二甲苯青*

3.5 100～2000 100 460

5.0 80～500 65 260

8.0 60～400 45 160

12.0 40～200 30 70

15.0 25～150 15 60

20.0 10～100 12 45

*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp)。

一器材及试剂

1.电泳仪，垂直电泳槽及其附件，玻璃板，常用实验器材等。

2.玻璃板处理试剂：

(1) KOH/甲醇溶液：5gKOH溶于100ml甲醇中，用于清洗玻璃板。

(2) 95%乙醇

(3) 亲和硅烷溶液：95%乙醇 4ml

冰乙酸 20ul

亲和硅烷 20ul

(4) 玻璃硅烷：用移液器取适量于短板上，用无尘擦拭纸涂抹均匀。

2.丙烯酰胺溶液45%

丙烯酰胺：43.4克

N，N'一亚甲基双丙烯酰胺：1.6克

H2O，加至100ml

装于棕色瓶内，4℃可保存二个月。

3.变性剂尿素0.7g/ml：称取175g溶于125ml左右水中，定容到250ml。

4.过硫酸铵0.1g/ml：称取过硫酰铵1g加水至10ml。4℃可保存一周，-20℃可保存一个月。

5.TEMED(四甲基乙烯基二胺)：和过硫酸铵一起作为交联反应的催化剂。易吸潮，4℃封闭保存。

6.1XTBE电泳缓冲液

TBE电泳母液(5×)的配制

1)分别称取54克Tris碱，27.5克硼酸，20ml 0.5mol/EDTA(PH=8.0)

2)将各组分别加入1升烧杯中，用ddH2O定容到1升。

3)在电泳时使用1倍工作液，按1：4与水混合。

4)1倍液是为了增加电泳工作液的电流的电流量。

5)盛于玻璃瓶，在室温保存。

使用同样的TBE配制胶和电泳液，因为两者间微小的差异就会导致DNA扭曲。

7.上样缓冲液:含有变性剂

8..超纯水及灭菌的超纯水

二聚丙烯酰胺凝胶的制备

根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶.

1.玻璃板处理：KOH/甲醇溶液或KOH溶液浸泡玻璃板一定时间，用去污剂和清水清洗干净，最后用双蒸水冲洗两遍。自然晾干。用95%乙醇擦拭长短板。长短板分别用亲和硅烷和玻璃硅烷均匀擦拭。5-10分钟后再用95%乙醇擦拭长短板。

2.固定玻璃板：处理面向上，把两个封条分别置于两侧，把梳子置于长板一端的两封条间。短板处理面向下盖到长板上，用夹子固定，再用胶带封闭除放有梳子一端外的其它三边缝，防止漏胶。把固定好的玻璃板长向倾斜适当角度(300)，短向倾斜角度(200-300)

3.配制胶溶液(5%)：原胶： 8.34ml

尿素： 45ml

5xTBE： 15ml

双蒸水：6.66ml

TEMED: 30-36ul

ASP： 240ul

注：由于尿素在室温难溶解，故在配制胶时应提前把尿素溶液置于55℃水浴中预热，是尿素完全溶解。

4.灌胶：把梳子取出，用注射器取大约50ml的胶溶液，缓缓地使胶溶液注入两板间，等胶溶液快要溢出时，把玻璃板放平，倒插梳子，用夹子夹紧使梳子和玻璃博间没有缝隙从而防止点样时串样，整个过程不要产生气泡。

5.凝固：灌完胶后，放于室温让其自然凝固，观察胶边沿出现折射线就表明胶以凝固。凝胶可立即使用，或保存于室温24小时，4℃48小时。

三聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.固定玻璃板于电泳仪：取掉玻璃板上的夹子，撕掉胶带，用清水冲洗干净玻璃板，短板向里固定于电泳仪支架上，即凹口板面向电泳液。

2.预电泳：取5xTBE200ml稀释到1000ml制成1xTBE。向电泳仪下端槽内倒1xTBE约500ml，向上槽倒1xTBE，使液面高于短板上沿。拔出梳子，并用注射器吸取适量电泳液把点样孔洗干净(因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则)。

打开变压器，调节电压为80W，预电泳30min。

3.电泳:

1)上样：插入梳子，在预电泳期间把选择性扩增产物94℃变性10min后，迅速置于冰上冷却。向选择性扩增产物中按2：1的比例加上样缓冲液并混匀，取5-6ul上样。

2)调节电压60W，电泳2小时左右。根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳。电泳完毕，关掉电泳仪。取下玻璃板，用冰袋冷却，准备显色。

聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出>10ng以上量的DNA条带.要求更高的灵敏度，可用银染。

四聚丙烯酰胺凝胶电泳的显色----银染

银染的原理：银离子和DNA结合，还原剂甲醛把银离子还原成银颗粒，使DNA条带呈黑褐色而显现出来。其灵敏度比EB高200倍，但银染色后，DNA不宜回收。

1.固定：固定液冰醋酸： 150ml(10%)

双蒸水：1350ml

把经冷却的胶板置于盛有1.5L的塑料盘中，摇床震荡30min左右。

2.洗胶：把经固定的胶板置于盛有1.5L双蒸水的塑料盘中清洗两次，每次2-4min。

3.染色：染色液硝酸银： 1.5g(0.1%)