现代生物分离技术在多肽蛋白质分离纯化中的应用

一、前言

随着基因工程和细胞工程的发展，尽管传统的分离方法（如溶剂萃取技术）已在抗生素等物质的生产中广泛应用，并显示出优良的分离性能，但它难以提取和分离蛋白质。其主要原因有两个：

被分离对象——蛋白质等在40～50℃便不稳定，开始变性，而且绝大多数蛋白质都不溶于有机溶剂，若使蛋白质与有机溶剂接触，也会引起蛋白质的变性。

萃取剂问题——蛋白质分子表面带有许多电荷，普通的离子缔合型萃取剂很难奏效。

新兴的生物分离技术反胶束萃取、双水相萃取和电泳在蛋白质的分离纯化方面显示出了自身的优势，并展现出了广阔的前景。

二、反胶束萃取

2.1 反胶束萃取技术及其萃取蛋白质的机理

2.1.1 反胶束及其萃取原理

反胶束（reversed micelle）是双亲物质在非极性有机溶剂中自发聚集体，又称为反胶团、逆胶束（inverse micelle）。双亲物质的这种胶团化过程的自由能变化主要来源于双亲分子之间偶极子－偶极子相互作用，除此之外，平动能和转动能的丢失以及氢键或金属配位键的形成等都可能参与这种胶团化过程。

在反胶束内部，双亲分子极性头基相互聚集形成一个“极性核”，可以增溶水、蛋白质等极性物质，增溶了大量水的反胶束体系即为微乳液（microemulsion）。水在反胶束中以两种形式存在：自由水（free water）和结合水（bound water），后者由于受到双亲分子极性头基的束缚，具有与主体水（普通水）不同的物化性质，如粘度增大，介电常数减小，氢键形成的空间网络结构遭到破坏等。

对于增溶了物质（如水，蛋白质等）的反胶束基本上都认为是单层双亲分子聚集的近似球体，并忽视胶束之间的相互作用。事实上，反胶束体系处于不停的运动状态，反胶束之间的碰撞频率为109～1011次/s，而且反胶束中的增溶物在频繁的交换。

2.1.2反胶束萃取蛋白质的机理

蛋白质溶解于小水池中（正萃，或称萃取），其周围有一层水膜及表面活性剂极性头的保护，使其避免与有机溶剂接触而失活。改变pH、盐浓度等条件蛋白质又可回到水相（反萃），实现了蛋白质的萃取分离、纯化目的。反胶团萃取蛋白质的机理目前尚不十分清楚。一般认为，萃取过程是静电力、疏水力、空间力、亲和力或几种力协同作用的结果，其中蛋白质与表面活性剂极性头间的静电相互作用是主要推动力。根据所用表面活性剂类型，通过控制水相pH高于或低于蛋白质的等电点（pI），达到正萃反萃的目的。

2.2 反胶束萃取蛋白质的应用

2.2.1 同时提取蛋白质和油脂：陈复生等在AO-异辛烷反胶束同时萃取花生蛋白和花生油的过程，采用正交试验分析讨论了影响萃取的主要因素得到了最佳萃取工业条件。萃取后，油进入有机相而蛋白质溶入反胶束中。克服了传统方法工艺复杂，得率低，蛋白质容易变性的缺点。同时用蒸馏方法将油和烃分开，提炼出了油脂。

2.2.2 分离蛋白质混合物：Chang在Aliquat336/异辛烷反胶束分离枯草杆菌中两种酶——淀粉酶和中性蛋白酶时，通过加入助表面活性剂丁醇，有效地分离了这两种不同等电点的酶。

2.2.3 从发酵液中分离和提纯酶：Krishnakant用AOT/异辛烷体系从土豆发酵液中提取酸性磷酸酶，在pH值8～10，萃取水相与有机相体积比为3：1，反萃水相与有机相体积比为1：1时得到最大活性的酸性磷酸酶。Sun在CB-卵磷脂亲和反胶束中加入Tween85，直接从鸡蛋清中提取了溶菌酶。而该反胶束系统还可以回收后反复使用。