目标蛋白粗提方法

狭义来讲，提取指制备物与细胞固体成分或其它结合成分的分离，由固相转入液相或从细胞内生理状态转入外界特定溶液环境的过程，即分离前期被提取物从破碎的细胞中释放出来的过程。如果被提取物程固相或与固体结合，提取时由固相转入液相，常称为固液萃取；如果被提取物已经呈液相存在，提取时由一液相转入转入另一互不相溶的液相，这种方法称为液液萃取。

广义来讲，提取又可称为抽提或萃取，贯穿在整个分离纯化过程中，如核酸制备中用氯仿或苯酚反复抽提除去蛋白质，分离DNA和RNA。

提取的好坏受到多种因素的影响，包括：

1）溶液 涉及到溶液中的保护成分、离子强度、PH值、温度、表面活性剂、变性剂（如尿素和盐酸胍）和粘稠度、溶液的更换；

2）材料 包括材料本身固有的特性、材料的选择和处理；

3）目的分子 目的分子的理化性质、存在方式和部位、含量；

4）其它因素 搅拌、提取时间的长短。

第一节 溶剂和溶解度

一.溶剂

一些常用溶剂按其极性的大小，可依顺序大体排列如下：饱和烃类<全卤代烃类<不饱和烃类<醚类<未全卤代烃类～脂类<酮类<醇类。

还可按形成氢键能力的大小，分为五类：

1）能形成两个以上氢键的溶剂分子 如水，其两个氢原子和一个氧原子都可以形成氢键；

2）能形成两个氢键的溶剂分子 既是氢键的供体又是氢键的受体，例如脂肪族的醇类；

3）只作质子受体的溶剂分子 如脂肪族的醚类；

4）只作质子供体的溶剂分子 如氯仿；

5）不能形成氢键的烃类 如四氯化碳。

1）和2）两类溶剂宜用于极性化合物的提取，3）和4）两类溶剂宜用于对溶液中弱极性或非极性化合物的提取。

二．溶解度

溶解度用于分离提纯有两个主要目的：1）选择一个对制备物溶解度大而对杂质溶解度小的溶剂，使制备物从组分中有选择地被孤立出来；2）或选择一个对制备物溶解度小而对杂质溶解度大的溶剂，使制备物从组分中沉淀或结晶出来。

1． 物质溶解性质的一般规律可归纳为如下几点：

1）极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性溶剂中；

2）碱性物质易溶于酸性物质中，酸性物质易溶于碱性物质中；

3）在极性溶液中，溶剂介电常数的减少伴随溶质溶解度的降低。

总之，符合"相似相溶"原则。

2． 影响物质溶解度的几个主要因素：

1）离子强度

A．有些物质，如DNA-蛋白，在高离子强度下溶解度增加。

B．另一些物质，如绝大多数球蛋白和酶，在低离子强度下溶解性增加，称为盐溶；而在高离子强度下溶解度下降，直至出现沉淀，称为盐析。

C．盐溶现象不仅在水溶液中发生，而且在低介电常数溶剂，如乙醇，也同样发生。故而稀盐液常用于大多数生化物质的提取。

2）PH 值

A．两性溶质分子，在等电点时易相互聚集，溶解度最低；而在远离等电点两侧的PH值时，溶解度增大。

B．一些酸性或碱性小分子物质，在PH值很低时酸性物质呈现非解离分子状态，而碱性物质呈现阳离子状态；反之，酸性物质呈现阴离子状态，而碱性物质呈现非解离分子状态。离子状态的物质，不论是阳离子或阴离子都易溶于水，非离子的分子状态则易溶于有机溶剂。

C．对蛋白质、酶、核酸等生物大分子来说，应避免过酸或过碱，一般控制在pH6-8范围。如单纯从溶解度考虑，等电点在酸性范围的蛋白或酶，可选用偏酸性溶液提取；等电点在碱性范围内，则选用偏酸性溶液提取，酸性条件还可解离目的蛋白与其它组分形成的离子键，并有利于细胞的溶解。

3）温度

A．温度的提高可增高物质的溶解度，减少溶液的粘度，有利于提取的进行。对于一些植物成分或某些小分子生化物质，提取温度常在50-70度。

B．热提取法虽然提高提取效率，但所得提取液含杂质较多，不如冷提取法。对绝大部分生物大分子而言，提取温度一般控制在0～10度之间，以防止生物大分子的变性。