细菌多重 PCR 快速检测

多重 PCR 是一种在普通 PCR 基础上建立的一种可以同时扩增多个目的片段的检测多种细菌分子生物学的技术，其利用多对特异性引物同时扩增，提高了扩增效率，节省了成本。优点在于检测的速度快、准确性高和操作简单，特别适用于临床、环境和食品检测等领域。

多重 PCR 技术是在常规 PCR 的基础上加以改进后的一种新型技术，其基本原理与常规 PCR 相同，是通过聚合酶链式反应来达到目的片段的扩增。

当 DNA 双链处于 90 ℃ 高温时，双链 DNA 会解旋成单链 DNA；当温度降到 60 ℃ 左右时，引物与特定的靶序列相结合; 当温度升到 72 ℃ 时即为 DNA 聚合酶的最适温度，在依靠多种 dNTPs 底物的基础上再通过碱基互补配对原则从而完成单链 DNA 的延伸工作，最终完成 DNA 双链的配对合成。

多重 PCR 与常规 PCR 的区别在于同一个反应体系中所加入的引物对数不同。多重 PCR 可以特异性扩增出多条目的 DNA 片段。反应体系的组成和 PCR 循环的条件需要经过优化以确保同时扩增多个 DNA 片段。理论上只要 PCR 扩增的条件合适，引物对的数量可以不限，但由于各种条件的限制，实际能够扩增的引物对数量是有限的（～1 000 对）。

目的菌株（以金黄色葡萄球菌为例），胰蛋白胨，细菌 DNA 提取试剂盒，LB 液体培养基，LB 固体培养基；PCR 热循环仪，PCR 扩增仪等。

1、引物设计：选择序列长度在 500 bp 以上的基因设计引物。先用 Primer 软件，之后通过 Oligo 软件和 BLASTN 算法进行分析，选择二聚体少，自身不会形成发卡结构，Tm 值在 60 ℃ 左右且与非 DNA 同源性较低的引物作为该基因的特异性引物，并送公司进行合成。最好进行引物评价实验。

2、提取目的菌株 DNA：吸取样品匀液，5 000 r/min 离心后弃去上清，参照细菌 DNA 提取试剂盒进行操作，提取样品的基因组 DNA。

3、测定 DNA 浓度及纯度： 当 260 nm/280 nm 的比值在 1.8-2.0 之间表明提取的基因组 DNA 质量较好。

4、多重 PCR 检测：将所提取的基因组 DNA 作为模板，以设计的引物（SU4, smal，clfA）进行多重 PCR 反应，25 μL 多重 PCR 反应体系为：2.5 Μl 10 X PCR Buffer，1.0 μL MgCl2（4 mM），2.5 μL dNTP Mixture（各 2.5 mM），0.5 μL Taq 酶（5.0 U），2.0 μL DNA 模板，引物（10umol），添加 SU4, smal，clfA 分别为 2.6 μL、0.5 μL、1 μL，ddH2O 补足至 25 μL。

5、PCR 反应程序为：① 94 ℃ 5 min；② 94 ℃ 30 s；③ 58 ℃ 30 s；④ 72 ℃ 45 s；⑤ 72 ℃ 10 min。②-④步重复 30 次。

6、配置 1.5% 琼脂糖凝胶，使用电泳检测多重 PCR 反应产物。

7、在 EB 液中染色 10~15 分钟后置于凝胶成像仪下查看电泳条带结果。

1. 当比值大于 2.0 表明提取的基因组 DNA 中 RNA 含量较高，应加入一定量的 RNase 酶去除溶液中的 RNA。

2. 目的片段长度不尽相同，而较小片段总是优先扩增；

3. 各对引物最佳 PCR 条件不相同，较长的片段需要较长的延伸时间。为了保证最终扩增产量的一致性，在优化反应条件的时候，尽可能选择有利于较大片段的扩增条件。

4. 多重 PCR 体系中，引物用量与扩增的目的片段长度有着正比内在关系，即扩增片段越长，所需引物相对越多，另外引物间的相互影响会导致扩增效果不佳。

5. DNA 聚合酶的最适浓度为每 25 uL 反应体积中添加 2 U，实际根据扩增效果进行轻微调整。

6. 高盐浓度会使长片段的扩增产物难于变性解链。因而长片段产物在低盐浓度下扩增效果较好，而短片段产物在高盐浓度下扩增效果较好。可以适当提高 PCR 缓冲液浓度，或者提高 K+ 浓度至 70~100 mM。

7. 不同的细菌类型和样品类型可能需要不同的提取和扩增方法，需要根据具体情况选择合适的方法。同时在进行 PCR 扩增反应时，需注意控制反应条件和减少污染，以确保准确性和可靠性。