克隆化酵母DNA的操作实验
一、简介尽管整合性转化的频率很低，但可以通过与整合位点同源的克隆化基因内的限制性位点将质粒线性化以提高转化效率。得到的整合体含有完整的质粒，两侧为基因的完整拷贝
一、简介
尽管整合性转化的频率很低，但可以通过与整合位点同源的克隆化基因内的限制性位点将质粒线性化以提高转化效率。得到的整合体含有完整的质粒，两侧为基因的完整拷贝。
二、操作方法
基因置换技术
三、材料与仪器
酵母
步骤
一、整合性破坏
1. 将基因的内部片段亚克隆到YIP载体。
2. 在此内部片段中将质粒线性化。
3. 继续整合性转化步骤3（见基本方案1）。
二、基因破坏一步法
1. 将合适的选择性基因亚克隆到目的基因上，必要时，可在亚克隆的同时引入一个缺失。
2. 采用合适的限制性位点，从步骤1抅建的质粒中切出含有被破坏基因的片段，凝胶电泳纯化。用1~10 μg 凝胶纯化片段进行转化并选择插入标记。
1. 将基因的内部片段亚克隆到YIP载体。
2. 在此内部片段中将质粒线性化。
3. 继续整合性转化步骤3（见基本方案1）。
二、基因破坏一步法
1. 将合适的选择性基因亚克隆到目的基因上，必要时，可在亚克隆的同时引入一个缺失。
2. 采用合适的限制性位点，从步骤1抅建的质粒中切出含有被破坏基因的片段，凝胶电泳纯化。用1~10 μg 凝胶纯化片段进行转化并选择插入标记。
3. Southern 杂交法确证破坏结果。如果转化二倍体，产生孢子后经剖分以获得带有被破坏基因的单倍体孢子。
三、转移
5. 通过突变表型筛选5-FOA菌落，如果突变体的限制酶切图谱与野生型基因相比有预期的改变，用Southern 杂交法确证突变菌落的基因型。
三、转移
1. 将目的基因亚克隆到YIp5，诱变质粒或者引入确定的缺失或插入突变。
2. 从质粒的线性化开始，按整合性转化方案进行（基本方案1）。
3. 将转化子在非选择性液体培养基（YPD或含尿嘧啶的极限培养基）中培养过夜，然后在非选择性培养基平板上30℃培养两天使长出克隆（约100单克隆）。
4. 将平板影印至5-FOA平板上培养过夜以鉴别Ura- 分离子，在液体培养基培养期间丟失了质粒的菌落在5-FOA平板上具有完全的抗性，这些克隆可以通过非选择性平板回收，并用于步骤5。其他在克隆生长期间丢失了质粒的菌落在5-FOA影印平板上将出现乳头状突起。
5. 通过突变表型筛选5-FOA菌落，如果突变体的限制酶切图谱与野生型基因相比有预期的改变，用Southern 杂交法确证突变菌落的基因型。
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