PNA 介导的钳制 PCR

PNA 介导的钳制 PCR，英文名是 peptide nucleic acids PCR clamping。PNA（肽核酸） 是一种以中性酰胺键为骨架并兼有多肽和核酸性质的独特化合物。PNA 与互补的 DNA 或 RNA 序列杂交具有极强的特异性和热稳定性；PNA 不易被蛋白酶和核酸酶降解；PNA/DNA 杂交结合强度与盐浓度无关。

PNA 介导的钳制 PCR 的基本原理：

检测基因中是否存在突变时，采用两条竞争性引物，一条是与野生型互补的 PNA 引物，一条是与突变型互补的 DNA 引物。当基因未发生突变时，PNA 引物与靶序列结合的能力高于 DNA 引物，而在 PNA 结合靶序列后，由于 PNA 不能通过 DNA 聚合酶而延伸，从而不能引起片段的扩增；当基因中存在突变时，DNA 引物与靶序列的结合强度高于 PNA 引物，产生扩增片段。PNA 引物也可以位于突变引物的下游或者是扩增片段的 内部，当 PNA 与靶位点结合后，也能阻止扩增反应的进行。

PNA 介导的钳制 PCR 可用于检测突变，还应用于微生物多样性分析、转基因植物的监测及食品来源的探究等方面。该方法还可与其它方法联合使用，如与 PCR－SSCP、RFLP 及实时 PCR 等。

器材：PCR 扩增仪

试剂：

① dNTP

② Taq DNA 聚合酶

③ 10× PCR 缓冲液

④ 无菌 PCR 管

⑤ 待检测的基因 （野生型及突变型）

⑥ DNA 引物 （包括正、反向引物）

⑦ PNA 引物

⑧ 去离子水或蒸馏水

PNA 介导的钳制 PCR 的基本过程可分为如下几步：

A. 将 PCR 管放置在一个架子上并排列标记好。

B. PCR 管中加入如下试剂：

C. 向 PCR 管中分别加入 1 ul 去离子水、野生型 DNA、突变型 DNA 以及野生型和突变型 DNA。

D. 混匀后，将 PCR 管放到 PCR 仪中，按下列程序开始循环：

E. 样品贮存于 4 ℃，或直接进行琼脂糖凝胶电泳分析。

要使突变位点位于 PNA 引物的中间，PNA 引物的 Tm 为 65~75 C。设计多条 DNA 引物，引物的 5' 端要比 PNA 引物长 5~10 nt，使突变位点也位于引物的中央。采用 4 步扩增法，与普通的 3 步 PCR 反应相比，增加了 PNA 退火过程。PNA 的退火温度比 PNA/DNA 的 Tm 值低 5 °C。

测试不同的 PNA 浓度（0.1~10 umol/L）对于 PCR 反应的抑制程度。如果没有抑制效应，增加 PNA 的浓度，并降低 PNA 退火温度；如果抑制过度，没有 PCR 产物出现，则增加 DNA 引物的浓度，并降低 PNA 引物的浓度。PCR clamping 技术中重要的一点，就是不需要在每个循环中都彻底抑制所有靶位点的扩增。