T接头介导PCR在转基因动物外源基因定位中的应用

T 接头介导 PCR 在转基因动物外源基因定位中的应用是分析外源基因的整合部位，获取高表达整合位点，同时也是对插入位点基因功能及表达调控研究的有效方法。

T 接头介导 PCR 在转基因动物外源基因定位中的应用基本原理是利用外源基因上的已知酶切位点，选择合适的酶对基因组 DNA 进行酶切，其中一些片段即包含部分外源基因序列；然后通过末端转移酶在 3’端加 poly d（T）尾，以消除片段的 3’凹端或平端（因带有 3’凹端或平端的 DNA 片段在 Tag DNA 聚合酶作用下将被补平，且在末端加上 A 碱基）。

再以外源基因的特异性引物 S1 进行单引物扩增，即可得到包含已知基因片段及旁侧序列的、且 3’末端多出一个 A 的目标片段，而其它不包含已知基因的 DNA 片段保持不变（即不产生 3’-A 尾）。目标片段与 T 接头在 T4 DNA 连接酶作用下进行连接；连接 产物先以 S1/W1 进行第一轮扩增，再用 S2/W2 进行第二轮扩增，得到目的产物。 对目的产物进行序列分析，即可确定外源基因的整合位点。

图解示意：

器材：

水浴锅、PCR 仪

试剂：

① 末端转移酶（TdT）

② 产生 3’突出端限制性内切酶

③ 牛血清白蛋白（BSA）

④ 基因组 DNA（常规方法提取）

⑤ 乙酸钠

⑥ 乙醇

T 接头介导 PCR 在转基因动物外源基因定位中的应用基本过程可分为如下几步：

（一）引物设计

根据已知基因片段序列设计侧翼克隆每步需要的特异性引物 S1、S2 和 T 接头特异引物 W1、W2。

（二）T 接头介导 PCR 反应步骤

(1）限制性内切酶酶切基因组

酶切反应：1 μg DNA，1.5 U 限制性内切酶，5 μl 10 × 缓冲液，去离子水补足至 50 μl；37 ℃ 孵育 20~30 min。

(2）在模板 DNA 中用末端转移酶（TdT） 加 poly（dT）n 尾

① 反应体系：1~5 μg 酶切基因组 DNA，10~50 U 的 TdT，5 μl 10 × TdT 缓冲液，5 μl 10 mmol/L dTTP，10 μl 0.1% BSA，去离子水补足至 50 μl；37 ℃ 孵育 30 min。

② 加入乙醇混合液（100 μl 乙醇 + 5 μl 3 mol/L 乙酸钠，pH5.2）沉淀 DNA，然后重新溶解于灭菌水中（20 μl)。

(3）用 LA Taq 聚合酶在靶分子的 3’末端特异性连接 A 碱基

① A 末端反应：8 μl 2.5 mmol/L dNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP 的混合物，每种 2.5 mmol/L)，2 U LATaq 聚合酶，25 μl 2 × GC 缓冲液Ⅰ，20 pmol 引物 S1，10 μl 消化 DNA[由（2）中 ② 步获得]，去离子水补足至 50 μl。然后进行单循环 PCR：94 ℃ 变性 3 min，55~60℃ 退火 2 min，72 ℃ 延伸 6~8 min，迅速置于冰上。

② 沉淀并重新溶解模板 DNA 于 8μl 灭菌水。

(4）靶分子和 T 接头的特异性连接

连接反应：7.5 μl 具有 A 尾的 DNA，2pmol T 接头，3U T4 DNA 连接酶（Weiss)，1 μl 10 × 连接缓冲液，去离子水补足至 10 μl；16 ℃ 连接 12~16 h。

(5) 第一轮巢式 PCR 扩增

① 反应体系Ⅰ：4 μl 2.5 mmol/L dNTP，1.25 U LA Taq 聚合酶，12.5 μl 2 × GC 缓冲液Ⅰ，10 pmol 引物 S1，10 pmol 引物 W1，1.5 μl 模板 DNA[第（4）步产物]，去离子水补至 25 μl。

② 反应条件：94 ℃ 预变性 3 min；94 ℃ 变性 1 min；55~60 ℃ 退火 1 min；72 ℃ 延伸 3 min；重复 34 循环；72 ℃ 最后延伸 10 min。

③ 用 20~50 μl 灭菌水稀释 1μl 第一轮 PCR 产物。

(6）第二轮巢式 PCR 扩增

① 反应体系Ⅱ：4μl 2.5 mmol/L dNIP，1.25 ULA Taq 聚合酶，12.5 μl 2 × GC 缓冲液Ⅰ，10 pmol 引物 S2，10 pmol 引物 W2，1 μl 稀释 PCR 产物 [第（5）③ 步产物]，去离子水补足至 25 μl。

② 体系Ⅱ的反应条件同第一轮 PCR[第（5）② 步]。

(7)PCR 产物的克隆和测序

反应Ⅱ的产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳分离特异性目的条带，然后将产物克隆并测序，即可确定外源基因整合位点。

1、限制性内切酶

限制性内切酶的选择是 T 接头 PCR 成功的关键，根据内切酶酶切位点和产生的末端来选择。在已知基因上选择单一内切酶，并且最好产生 3'突出端，避免 T 接头与片段的非特异性结合。

2、引物的设计

已知序列上的 S1、S2 两条引物的位置同巢式 PCR 的引物位置，S1 在最外侧，S2 在 S1 的里面；同理 T 接头处的 W1 和 W2 两引物也是 W1 在最外侧，W2 在 W1 的里面。

3、其它

条件优化主要考虑因素：接头的连接效率和选择合适的酶切位点，其非特异性产物主要来自单个接头引物的扩增。