Real-time PCR（基本方法二）
材料与仪器
关于 Trizol Reagent 需要的试剂
1. Chloroform：氯仿 (分析纯)
2. Isoproplyl alcohol：异丙醇(分析纯)
3. 75% Ethanol（in DEPC-treated water）:75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。
4. RNase-free water：无Rnase的水。方法是：将DEPC按0.01%（V/V）加在dH2O中500 ml（50 ul），在37 ℃过夜，并高压灭菌即得（150 ℃ 3小时）
5. 一次性塑料手套
6. 注意：DEPC 致癌之嫌
7. 抽提出的细胞总 RNA 干燥后加水 50 ul，取10 ul 加无 Rnase 水 990 ul，稀释100倍成1 ml。于 0.5 cm 厚的石英比色杯中，以无Rnase水为对照，在721型紫外分光光度计下检测，结果应为：A260/280 ratio <1.6。
8. 分离组织 10 mg（纯组织）加 800 ul Trizol 试剂。
步骤
DEPC 处理方法如下
1. DEPC处理
（1）DEPC水：100 ml超纯水加入0.2 ml DEPC，充分混匀，高压灭菌。
（2） Tip头(枪头）. EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材（包括1 ml. 200 μl. 20 μl Tip头；EP管和PCR反应管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超纯水加入1ml DEPC）37 ℃浸泡过夜，高压灭菌。
2. 提取RNA，用 DEPC 水溶解
3. RT 我是用PCR仪来控制温度和时间的，所以RT是在PCR反应管中作的。
4. 操作过程中要戴一次性手套，并经常换手套。 最好把要直接接触样品的东西都用DEPC水处理一下，枪头盒插好枪头后，加入1-2 ml的0.1%DEPC水，再灭菌就行了；现在有进口的 RNASE FREE 的枪头买，直接用不用处理的。
如何消除污染？
机器运行完后，取出PCR产物时不能随便丢弃，应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。
（1） 试剂：mixer尽量分装，不要原瓶多次取用。
（2） 加样：原则是DNA最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均匀之后再分装到各个管子里去，这样可以有效地避免误差及污染。 另外，普通实验室容易污染，且污染程度很高，与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系，最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。 目前，国内外各个公司提供的诊断试剂盒大多采用了UNG来防污染。Uracil-DNA N-glycosylase（UNG）尿嘧啶DNA糖基酶，来源于大肠杆菌重组克隆表达。
RNA 定量
RNA也最好至少要用电泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度计比较不同标本之间就更不准了。 RNA的贮藏，最主要的是温度，-20不够，最好-80，液氮最保险 mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因为还有翻译效率和RNA降解速度的影响。
RT-PCR有两种做法
条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行 一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的 电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量。
mRNA的分离与纯化
步骤（4）中将RNA溶液置65 ℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。
下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法：
保温试验方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1 000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70 ℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20 ℃冰箱中保存1 h。 时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件）， 则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70 ℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。
PCR污染与对策
1. PCR扩增产物污染
这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，所以，扩增区的仪器什么如枪头等要注意。 还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
1)标本处理区，包括扩增摸板的制备；
2)PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增；
3)产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。
各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。 切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。 使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染； 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度。
2. 反应液污染 可采用下列方法之一处理：
1)DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5 U DNase I，室温反应30 min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列；
2)尿嘧啶糖苷酶（UNG）法 由于UV照射的去污染作用对500 bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300 bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。
a、提取mRNA时所用的EP管、玻璃等器皿全部都要用0.1%DEPC水浸泡。然后烘干，高压灭菌，再烘干。
b、用DEPC水洗过后当然不能用双蒸水洗了。那你用DEPC处理还有什么意义呢？还要用双蒸水洗吗？
c、玻璃器皿干烤：180度，8小时或更长时间；小器皿也可以用少许氯仿处理一下。另外，铁制品、研砵等也可倒上酒精直接烧。
注意事项
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