核糖克隆实验
材料与仪器ATEN 缓冲液 DNA 缓冲液（TEN) KLA 缓冲液 T5E5 Dpn I Klentaq LA 蛋白酶 K 蛋白酶K储存缓冲液 RNA 酶 A
材料与仪器
ATEN 缓冲液 DNA 缓冲液（TEN) KLA 缓冲液 T5E5 Dpn I Klentaq LA 蛋白酶 K 蛋白酶K储存缓冲液 RNA 酶 A 设计好的载体 已经进行 5'端生物素-TEG 修饰 并且 3'端核糖胞嘧啶或者核糖尿嘧啶修饰过的引物 卡那霉素（Sigma) 四环素 Ticarcillin
电转化仪器 PCR(薄壁）试管 管壁厚度规则的试管 链霉抗生物素蛋白珠子
电转化仪器 PCR(薄壁）试管 管壁厚度规则的试管 链霉抗生物素蛋白珠子
步骤
—、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂.
10XATEN 缓冲液
0.5mol/LTris-HCl,pH7.9
2.5mol/L 氯化钠
0.25mol/L Na4EDTA,pH7.9
甜菜碱（SigmaB-2629)
蓝色葡聚糖（bluedextran)(SigmaD-5751)
DNA 缓冲液（TEN)
10mmoI/LTris-HCl,pH7.9
10mmol/L 氯化纳
0.1mmol/L EDTA
乙醇, 用 25% 的 DNA 缓冲液配成 75%
10X KLA 缓冲液
500 mmol/L Tris-HCl 碱 (Sigma;TrizmaBase)
160 mmol/L 硫酸铵
1%Tween20
25 mmol/L 氯化铁
未调整前 pH 为 9.2, 逐滴加入盐酸调整 pH 到 7.9，单独取出液滴来检测 pH, 以防 pH 计探针上的DNA 污染缓冲液。
30% 聚乙烯乙二醇 3350(PEG),1.5mol/L 氯化钠
乙酸钠，3mol/L，pH5.6
T5E5
5 mmol/L Tris-HCl,pH7.9
5 mmol/L Na4EDTA,pH7.9
2. 酶和酶缓冲液
Dpn I
Klentaq LA(Barnes1994；Clontech8421-1)
蛋白酶 K(Roche1373196)
蛋白酶 K 储存缓冲液
100umol/L β-巯基乙醇
20 mmol/L Tris-HCl，pH7.9
1mmol/LCaCl2
50%(体积分数）甘油（630 g/L)
RNA 酶 A(Ambion2270 或 2272)
3. 核酸和寡核苷酸
设计好的载体
已经进行 5'端生物素-TEG 修饰，并且 3'端核糖胞嘧啶或者核糖尿嘧啶修饰过的引物
4. 抗生素
卡那霉素（Sigma), 终浓度为 25ug/ml
四环素 (Calbiochem)，终浓度为 12ug/ml
Ticarcillin(SmithKline Beecham)，终浓度为100ug/ml
5. 专用设备
电转化仪器
PCR(薄壁）试管；管壁厚度规则的试管；0.5 ml 或 1.7 ml
链霉抗生物素蛋白珠子
6. 细胞和组织
电击感受态细胞（Dower et al.1988;Invitrogen 18290-015)
二、方法
1. 应用末端为核糖胞嘧啶或者核糖尿嘧啶的引物和 KLA 缓冲液（PH7.9) 分别在1.3mol/L 和 1.9mol/L 的甜菜碱中扩增目标片段和载体序列。一些载体的质粒复制子在 pH9.2 条件下标准的长 PCR 反应中扩增得更好，但是 colEl 复制子在 pH7.9 条件下扩增得好。
为了得到最佳的扩增效率，应该使用已经进行 5'端生物素-TEG 修饰过的引物和如下所述的链霉抗生物素蛋白珠子，与其他 DNA 聚合酶相比，Klemaq LA 酶混合物（BameS1994) 得率更高，而且它对甜菜碱的抗性更强（Baskaran et al.1996)。
以质粒做模板的 PCR 效率稍高，并且如果在 PCR 之前用限制酶将模板线性化，模板转化进大肠杆菌细胞造成的最终背景要低些。
如果用来扩增栽体或目标片段的模板来自 dam+大肠杆菌，Dpn I 选择通常是个好的办法，并且可能会导致后续克隆步骤中出现不必要的背景。Dpn I 不能酶切 PCR 产物，因为含有非甲基化的 GATC 位点 (Weiner et al.1994)。
2. 向每个100ul 的 PCR 反应中，加入 1ul(10U)Dpn I,37°C 温浴 2 h。
这种处理可以把单纯载体或单纯目标片段的背景降到 0~20 个菌落。
3.PEG 沉淀步骤。这步的目的是要除去引物和盐。把 PCR 反应移到厚壁（管壁厚度均匀）试管，0.5 ml 或 1.7 ml 都可以，因为薄壁 PCR 试管不能用来离心。然后，加入 5ul lmg/ml 蓝色葡聚糖（用它来显示沉淀的位置）和 1/2 体积 30%PEG3350、1.5mol/L 氯化钠（最终为 10%PEG，0.5mol/L 氯化钠）。室温放置 30 min 或 4°C 过夜。离心 15 min。看着蓝色沉淀倒去上清液，以免不小心倒掉沉淀。如果沉淀很薄看不见，尽董避免倒掉沉淀，但是同时保留上清液。用 75% 乙醇淋洗沉淀，离心 8 min。在空气中干燥沉淀 10~20 min。用 100ul 的 T5E5 缓冲液重悬沉淀，置于冰上至少 lOmin, 并不时振荡。
4. 胰腺 RNA 酶 A 步骤。用 T5E5 缓冲液稀释 200ugRNA 酶 A 到 200ug/ml。也可以使用 DNA 缓冲液（E.Oates，个人交流）。向每 100ul 的 PCR 产物中加入 6ug（30ul)RNA 酶，振荡并轻轻离心。然后把含有 RNA 酶的 PCR 产物放在 55°C 温浴 30 min，冷却。
5. 蛋白酶 K 步骤。应该用蛋白酶 K 保存缓冲液将酶在-20°C 保存（见材料单）。加入 5ug 蛋白酶 K 或大约相同质量（6ug) 的上述 RNA 酶，充分混合，稍微离心一下，65°C 温浴 30 min，冷却。
如果使用生物素引物，立即逬行下述的珠子纯化步骤。否則 DNA 就已经准备好了。
6. 克隆步骤。取 2~8ul 的载体或目标片段样品进行琼脂糖凝胶电泳，并在旁边加一个浓度标准，用来同时确定载体 DNA 和目标片段的浓度。克隆时它们的物质的量应该相等，浓度是否精确并不重要。
1~10ul 载体=30~100ng，0.02pmol
1~10ul 目标片段=5~25ng(目标片段和载体物质的量相等）
加入 1XATEN 缓冲液至 40ul
7. 各取 20ul 克隆混合物作不同的对照，比如在加热前、没有加热、凝胶样品等的对照。按比例配制更多所需的克隆混合物。最小用 40ul:20ul 做凝胶电泳，20ul 用来转化细胞。
8. 珠子纯化的 DNA 可不需要退火，因为它似乎在室温下可以进行自组装（数据没有给出），但是这个加热步骤对非生物素引物非常有帮助。
78°C 溫浴 2 min, 然后 52°C 溫浴 30 min; 或者，先 78°C 溫浴 2 min，再 65°C 溫浴 lOmin, 然后在大于 30 min 的时间内慢慢地把温度降到 52°C 或者更低，冷却。保存 20ul 用作退火后凝胶检测样品。
这些凝胶样品可以用来检测和提高重组效率。常规克隆时可以跳过这步不做，但是，就像做任何 DNA 克隆实验一样，如果出错了，实验者不做凝胶分析就不知道是什么发生了错误.
9. 加入 1/9 或者 1/6 体积的 3mol/L 乙酸钠（pH5.6) 和 2 mg 蓝色葡聚糖，加入 2~3 倍体积的乙酵沉淀 DNA, 在-20°C 冷藏至少 30 min, 然后离心 10~15 min。用 75% 乙醇：25%DNA 缓冲液淋洗可见的沉淀，然后离心 8 min。在这步 75% 乙醇淋洗中，在 DNA 缓冲液中加入了少量的盐，这样 25bp 的黏性末端就不会在下面的步骤中解链。
10. 在冰上用 22ul 的水重悬干燥的沉淀，加入的水会由于蓝色葡聚糖变成轻微的蓝色。
取出用作电泳样品或者作为转化的备份。
11. 用 15ul 的 DNA 去电击转化 70ul 的电击菌感受态，在 5s 中之内加入 1ml 的丰富培养基，然后将其涂在恰当的抗生素培养基上：10min 后涂在 100ug/ml 替卡西林板上，或者 30°C 5~16 h 后涂在 25ug/ml 的卡那霉素板上，或者在 30°C 2 h 后涂在 12ug/ml 的四环素平板上。延长电转化后的培养时间对于表达一些抗生素基因的抗性是必需的。
1. 缓冲液、溶液和试剂.
10XATEN 缓冲液
0.5mol/LTris-HCl,pH7.9
2.5mol/L 氯化钠
0.25mol/L Na4EDTA,pH7.9
甜菜碱（SigmaB-2629)
蓝色葡聚糖（bluedextran)(SigmaD-5751)
DNA 缓冲液（TEN)
10mmoI/LTris-HCl,pH7.9
10mmol/L 氯化纳
0.1mmol/L EDTA
乙醇, 用 25% 的 DNA 缓冲液配成 75%
10X KLA 缓冲液
500 mmol/L Tris-HCl 碱 (Sigma;TrizmaBase)
160 mmol/L 硫酸铵
1%Tween20
25 mmol/L 氯化铁
未调整前 pH 为 9.2, 逐滴加入盐酸调整 pH 到 7.9，单独取出液滴来检测 pH, 以防 pH 计探针上的DNA 污染缓冲液。
30% 聚乙烯乙二醇 3350(PEG),1.5mol/L 氯化钠
乙酸钠，3mol/L，pH5.6
T5E5
5 mmol/L Tris-HCl,pH7.9
5 mmol/L Na4EDTA,pH7.9
2. 酶和酶缓冲液
Dpn I
Klentaq LA(Barnes1994；Clontech8421-1)
蛋白酶 K(Roche1373196)
蛋白酶 K 储存缓冲液
100umol/L β-巯基乙醇
20 mmol/L Tris-HCl，pH7.9
1mmol/LCaCl2
50%(体积分数）甘油（630 g/L)
RNA 酶 A(Ambion2270 或 2272)
3. 核酸和寡核苷酸
设计好的载体
已经进行 5'端生物素-TEG 修饰，并且 3'端核糖胞嘧啶或者核糖尿嘧啶修饰过的引物
4. 抗生素
卡那霉素（Sigma), 终浓度为 25ug/ml
四环素 (Calbiochem)，终浓度为 12ug/ml
Ticarcillin(SmithKline Beecham)，终浓度为100ug/ml
5. 专用设备
电转化仪器
PCR(薄壁）试管；管壁厚度规则的试管；0.5 ml 或 1.7 ml
链霉抗生物素蛋白珠子
6. 细胞和组织
电击感受态细胞（Dower et al.1988;Invitrogen 18290-015)
二、方法
1. 应用末端为核糖胞嘧啶或者核糖尿嘧啶的引物和 KLA 缓冲液（PH7.9) 分别在1.3mol/L 和 1.9mol/L 的甜菜碱中扩增目标片段和载体序列。一些载体的质粒复制子在 pH9.2 条件下标准的长 PCR 反应中扩增得更好，但是 colEl 复制子在 pH7.9 条件下扩增得好。
为了得到最佳的扩增效率，应该使用已经进行 5'端生物素-TEG 修饰过的引物和如下所述的链霉抗生物素蛋白珠子，与其他 DNA 聚合酶相比，Klemaq LA 酶混合物（BameS1994) 得率更高，而且它对甜菜碱的抗性更强（Baskaran et al.1996)。
以质粒做模板的 PCR 效率稍高，并且如果在 PCR 之前用限制酶将模板线性化，模板转化进大肠杆菌细胞造成的最终背景要低些。
如果用来扩增栽体或目标片段的模板来自 dam+大肠杆菌，Dpn I 选择通常是个好的办法，并且可能会导致后续克隆步骤中出现不必要的背景。Dpn I 不能酶切 PCR 产物，因为含有非甲基化的 GATC 位点 (Weiner et al.1994)。
2. 向每个100ul 的 PCR 反应中，加入 1ul(10U)Dpn I,37°C 温浴 2 h。
这种处理可以把单纯载体或单纯目标片段的背景降到 0~20 个菌落。
3.PEG 沉淀步骤。这步的目的是要除去引物和盐。把 PCR 反应移到厚壁（管壁厚度均匀）试管，0.5 ml 或 1.7 ml 都可以，因为薄壁 PCR 试管不能用来离心。然后，加入 5ul lmg/ml 蓝色葡聚糖（用它来显示沉淀的位置）和 1/2 体积 30%PEG3350、1.5mol/L 氯化钠（最终为 10%PEG，0.5mol/L 氯化钠）。室温放置 30 min 或 4°C 过夜。离心 15 min。看着蓝色沉淀倒去上清液，以免不小心倒掉沉淀。如果沉淀很薄看不见，尽董避免倒掉沉淀，但是同时保留上清液。用 75% 乙醇淋洗沉淀，离心 8 min。在空气中干燥沉淀 10~20 min。用 100ul 的 T5E5 缓冲液重悬沉淀，置于冰上至少 lOmin, 并不时振荡。
4. 胰腺 RNA 酶 A 步骤。用 T5E5 缓冲液稀释 200ugRNA 酶 A 到 200ug/ml。也可以使用 DNA 缓冲液（E.Oates，个人交流）。向每 100ul 的 PCR 产物中加入 6ug（30ul)RNA 酶，振荡并轻轻离心。然后把含有 RNA 酶的 PCR 产物放在 55°C 温浴 30 min，冷却。
5. 蛋白酶 K 步骤。应该用蛋白酶 K 保存缓冲液将酶在-20°C 保存（见材料单）。加入 5ug 蛋白酶 K 或大约相同质量（6ug) 的上述 RNA 酶，充分混合，稍微离心一下，65°C 温浴 30 min，冷却。
如果使用生物素引物，立即逬行下述的珠子纯化步骤。否則 DNA 就已经准备好了。
6. 克隆步骤。取 2~8ul 的载体或目标片段样品进行琼脂糖凝胶电泳，并在旁边加一个浓度标准，用来同时确定载体 DNA 和目标片段的浓度。克隆时它们的物质的量应该相等，浓度是否精确并不重要。
1~10ul 载体=30~100ng，0.02pmol
1~10ul 目标片段=5~25ng(目标片段和载体物质的量相等）
加入 1XATEN 缓冲液至 40ul
7. 各取 20ul 克隆混合物作不同的对照，比如在加热前、没有加热、凝胶样品等的对照。按比例配制更多所需的克隆混合物。最小用 40ul:20ul 做凝胶电泳，20ul 用来转化细胞。
8. 珠子纯化的 DNA 可不需要退火，因为它似乎在室温下可以进行自组装（数据没有给出），但是这个加热步骤对非生物素引物非常有帮助。
78°C 溫浴 2 min, 然后 52°C 溫浴 30 min; 或者，先 78°C 溫浴 2 min，再 65°C 溫浴 lOmin, 然后在大于 30 min 的时间内慢慢地把温度降到 52°C 或者更低，冷却。保存 20ul 用作退火后凝胶检测样品。
这些凝胶样品可以用来检测和提高重组效率。常规克隆时可以跳过这步不做，但是，就像做任何 DNA 克隆实验一样，如果出错了，实验者不做凝胶分析就不知道是什么发生了错误.
9. 加入 1/9 或者 1/6 体积的 3mol/L 乙酸钠（pH5.6) 和 2 mg 蓝色葡聚糖，加入 2~3 倍体积的乙酵沉淀 DNA, 在-20°C 冷藏至少 30 min, 然后离心 10~15 min。用 75% 乙醇：25%DNA 缓冲液淋洗可见的沉淀，然后离心 8 min。在这步 75% 乙醇淋洗中，在 DNA 缓冲液中加入了少量的盐，这样 25bp 的黏性末端就不会在下面的步骤中解链。
10. 在冰上用 22ul 的水重悬干燥的沉淀，加入的水会由于蓝色葡聚糖变成轻微的蓝色。
取出用作电泳样品或者作为转化的备份。
11. 用 15ul 的 DNA 去电击转化 70ul 的电击菌感受态，在 5s 中之内加入 1ml 的丰富培养基，然后将其涂在恰当的抗生素培养基上：10min 后涂在 100ug/ml 替卡西林板上，或者 30°C 5~16 h 后涂在 25ug/ml 的卡那霉素板上，或者在 30°C 2 h 后涂在 12ug/ml 的四环素平板上。延长电转化后的培养时间对于表达一些抗生素基因的抗性是必需的。
相关文章
