顺磁性链霉抗生物素蛋白珠子的纯化实验

ATEN 缓冲液 聚乙烯乙二醇 T5E5 缓冲液 Dpn I 蛋白酶 K RNA 酶 A 5'端为生物素-TEG 且 3'端为核糖胞嘧啶的引物 蛋白酶 K 处理过的 PCR 产物
磁铁 链霉抗生物素蛋白珠子

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

1X ATEN 缓冲液（见第 1 步）

10X ATEN 缓冲液（见方案 1 的配方）

聚乙烯乙二醇 (30%PEG,1.5mol/L 氯化钠）

T5E5 缓冲液（见方案 1 的配方）

2. 酶和酶缓冲液

Dpn I

蛋白酶 K

RNA 酶 A

3. 核酸和寡核苷酸

5'端为生物素-TEG 且 3'端为核糖胞嘧啶的引物

蛋白酶 K 处理过的 PCR 产物

4. 专用设备

磁铁

链霉抗生物素蛋白珠子（强烈推荐使用 Genoviskm 公司的产品）

二、方法

1. 用 5'端为生物素-TEG 且 3'端为核糖胞嘧啶的引物扩增目标片段。PCR 后，按方案 1 所述的操作进行 Dpn I、PEG 沉淀，在 T5E5 中进行 RNA 酶和蛋白酶 K 处理。加入 1/9 体积的 10XATEN 缓冲液使样品最终含有 1XATEN 缓冲液。

2. 预沉淀珠子。在储存试管中取出一些链霉抗生物素蛋白珠子，磁化它们，然后除去储存缓冲液。用 10 倍体积的 1X ATEN 缓冲液淋洗珠子 2 次（其中的一次要在 80C 浸泡 5~lOmin)。用原始体积的 1XATEN 缓冲液重悬珠子，可以在 4°C 中最多放置 2 周。
淋洗的目的之一就是除去松散的链霉抗生物素蛋白。残留的蛋白酶 K 不会破坏链霉抗生物素蛋白珠子。

3. 对于每一个 130ul 的蛋白酶 K 处理过的 PCR 产物，加入 15ul 的 10XATEN 缓冲液，然后 52°C 温浴 30 min。有时，前面的 RNA 酶步骤或者是 65°C 蛋白酶 K 步骤会使一些引物熔化掉。髙盐温浴可以保证让酶切好的引物暂时回到它们原来所处的黏性末端的相应位置上，以便让 5'端的生物素把它们挂到珠子上。如果没有这个重新退火的过程，一半的产物有时不能粘在一起。加入60~100ul 在步骤 2 中所准备好的重悬于 1XATEN 缓冲液的链霉抗生物素蛋白珠子，25°C 温浴 30 min, 磁化它们。保留珠子的上清液，取一些电泳检测珠子吸收的效率。

4. 用 200~500ul 的 1XATEN 缓冲液快速淋洗珠子 1~2 次，以除去更多的最初 PCR 模板和 RNA 酶。

5. 用 100ul 的 1XATEN 缓冲液在 80°C 加热洗脱珠子 2~3 次，每次 3~5 min。把试管移到 80°C 含有磁铁的热模块孔中几分钟。

6. 一次一个人用手握着温热的试管靠近一个磁铁，或者放在磁铁架上，然后趁热吸取上清液。这就是含有 3'黏性末端的核糖克隆的 DNA。磁化这个含有 DNA 的上清液，或者离心，最后一次除去痕量的珠子，然后把它转移到一个新管中。冰冻保存最多 2 周。

7. 这个 DNA 可以用来克隆。DNA 现在溶解于 1XATEN 缓冲液，保证在退火过程中 ATEN 的最终水平是 1X。按方案 1 所述的第 5 步开始克隆。