质粒DNA的分离、纯化和鉴定（二）

（一）碱法

1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。 2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。

3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。

4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。

5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心5-10分钟。

6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g离心5分钟。

7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。

8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g离心5-10分钟。 9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。

10、将沉淀溶于20μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。

[注意]

1. 提取过程应尽量保持低温。

2. 提取质粒DNA 过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提。

3. 沉淀DNA 通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA 沉淀完全。沉淀DNA 也可用异丙醇(一般使用等体积),且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇。

（二）Wizard少量 DNA 纯化系统

Promega公司的Wizard少量DNA 纯化系统可快速有效的抽提质粒DNA ,整个过程只需15分钟。提取的质粒可直接用于DNA 测序、酶切分析和体外转录等。

该系统中所含试剂和柱子可以用于50次1-3ml质粒培养液的分离和纯化，试剂包括10ml细胞悬浮液，10ml细胞裂解液；10ml中和液，50ml Wizard少量DNA 纯化树脂，50ml柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml )和50支Wizard微型柱。

1、 1-3ml过夜培养细胞液4℃下 12000g离心1-2分钟。

2、去除上清液，菌体细胞悬浮于200μl 细胞悬浮液中,充分混合,并移入eppendorf管中。

3、 加200μl 细胞裂解液, 颠倒离心管数次,直到溶液变清亮。

4、加200μl 中和液,颠倒离心管数次。

5、4℃下12000g离心5分钟，取上清液于新的eppendorf管中。

6、加1ml Wizard少量 DNA 纯化树脂,颠倒离心管数次以充分混匀。

7、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒与Wizard微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注射筒中,并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。