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PCR

RT-PCR简介

2024-11-19 PCR 加入收藏
主要内容 RT-PCR原理 RT-PCR步骤 常见问题分析两步法RT-PCR 一步法RT-PCR 两步法与一步法RT-PCR比较RT-PCR主要用途 分析基因的

主要内容 RT-PCR原理 RT-PCR步骤 常见问题分析

两步法RT-PCR 一步法RT-PCR 两步法与一步法RT-PCR比较

RT-PCR主要用途 分析基因的转录水平获取目的基因合成cDNA探针 逆转录酶的选择 AMV:禽成髓细胞瘤病毒,逆转录酶和 RNA 酶H活性。最适42℃,最新版本可达60 ℃ (Bioflux公司)。MMLV:Moloney 鼠白血病病毒,逆转录酶, RNA 酶H活性较弱。最适37℃,最新版本42 ℃(赛百盛)Super RNaseH- Reverse TranscriptaseMMLV反转录酶的RNase H-突变体,它能将更大部分的 RNA 转换成cDNA,最适42℃。(Tiangen天根生化)RNase H的作用水解 RNA -DNA杂合链中的 RNART-PCR引物的选择随机引物:适用于长的或具有发卡 结构的 RNA ,特异性最低。起始浓度范围为20µl体系50-250µg。Oligo(dT15-18):适用于具有PolyA尾巴的 RNA 。起始浓度范围为20µl体系0.2-0.5µg。特异性引物:与目的序列互补,是反义寡核苷酸,适用于目的序列已知的情况。起始浓度范围为20µl体系1pmol。提高RT-PCR灵敏度1.分离高质量 RNA2.使用无RNaseH活性的逆转录酶3.提高逆转录酶保温温度4.减少基因组DNA污染 RT常见问题

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