PCR在DMS/BMD基因诊断中的应用

PCR 在DMS/BMD基因诊断中的应用 　　DMD(Duchenne Muscular Dystrophy)和BMD(Becker Muscular Dystrophy)是一种常见的X连锁隐性遗传病，主要发生于男性，其发病率为1/3500活产男婴，其发生的原因是Dystrophin(抗肌萎缩蛋)其固缺陷所致. 一、DMD/BMD的临床表现 　　在临床上DMD较BMD常见，发病早，症状重，正常于2-3岁即出现骨骼肌无力的表现，一般从骨盒带肌肉无力开始而出现一系列的特殊症状:走路困难呈鸭步，出现Gower's征，腓肠肌进行性肥大.逐渐出现心肌细胞受损，约30%的小儿智能力缺陷.在12岁左右失去能力，至20岁时正常死于呼吸衰竭和心力衰竭.而BMD相对来说症状较轻，进展亦较慢. 二、DMD/BMD的遗传病 　　(一)遗传方式:X-连锁隐性遗传，发病者多为男性，其母亲为致癌基因携带者，尚有1/3的患者为散发病例，则新生突变引起. 　　(二)，DMD/BMD的致病基因:1.基因定位:DMD/BMD是因位于Xq21，其基因非常大约为2400Kb.2.基因结构:该基因共有79个外显子，78个内含子，其CDNA全长约为13974个时，编码的肽链含3685aa残基，编码蛋白命名为dystrophine，其基本5个独立的启动子，在DMD基因内还存在一些STR，已知有13个STR，其中5'端编码区有8个，3'端编码区有1个，44，45，49，30，50内含子各有一个STR，是多为DNDR核心是(CA)n.等位基因数目为2-19个. 三、DMD基因的突变类型 　　(一)缺失与重复:研究表明约65%的DMD/BMD是由于基因内的部分缺失所致，尚有12.5%病例有基因内重复，这种突变变有两个高频发生区，一个在基因的5端，另一个大致在第45～55外显子区域，而5'端的缺失重复热点大致在第1～7外显子区域.缺失的范围从1至数个外显子，甚至整个DMD基因亦可发生缺失，启动子区亦有缺失发生. 　　(二)单碱量换:近年来的研究还发现，在DMD基因内尚有单碱其置换，目前已发现的约有6种，根认为在DMD患者中由此型突变引起者占30%左右. 　　(三)基因内连接形成和mRNA剪接异常:以上两种类型的突变亦在DMD人群中有抗，但因研究的病印例尚少，需要进上步的研究. 四、利用PCR 技术诊断DMD的途径

(一)用PCR 技术检测缺失型突变. 　　利用PCR 可直接检出DMD/BMD的缺失型突变，由于DMD/BMD发生时，其65%的患者为基因缺失所致，因此直接检测缺失可使65%的患者得到诊断.在DMD/BMD基因的缺失中，其缺失范围，缺失的位置具有高度异质性，加之DMD/BMD基因较大，很难用一对引物确定其缺失部位，随着DMD/BMD基因的克隆及其精结构的阐明，有人开发了多时引物进行多重PCR ，从而可使几乎全部的缺失型DMD/BMD得到诊断. 　　1.利用6对引物扩增处于缺失热点区域的6个外显子，即外显子8，16，19，44，45和48，再加上外显子4，12，51的3对引物，可检测80%的缺失，若再用Beggs等设计的另外九对引物即外显子3，6，13，46，47，49，50，52，30，60及启动子的引物，进行多重PCR ，可使98%的缺失型患者得到诊断，各引物的序列及扩增片段大小见表. 　　在用多重PCR 进行DMD/BMD基因的缺失型检测时方便简便，快速，在扩增后，用琼脂糖凝胶电泳溴乙锭染色可根据扩增产物的有无判断结果.扩增时的分清情况见下表:

DMD基因PCR 扩增引物

外显子 引物序列(5'--3') 产物片段 PmGAAGATCTAGACAGTGGATACATAACAAATGCATG 535 　TTCTCCGAAGGTAATTGCCTCCCAGATCTGAGTCC 　 3TCATCCATCATCTTCGGCAGATTAA 410 　CAGGCGGTAGAGTATGCCAAATGAAAATCA 　 4TTGTCGGTCTCCTGCTGGTCAGTG 196 　GAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 　 6CCACATGTAGGTCAAAAATGTAATGAA 202 　GTCTCAGTAATCTTCTTACCTATGACTATGG 　 8GTCCTTTACACACTTTACCTGTTGAG 360 　GGCCTCATTCTCATGTTCTAATTAG 　 12GATAGTGGGCTTTACTTACATCCTTC 331 　GAAAGCACGCAACATAAGATACACCT 　 13AATAGGAGTACCTGAGATGTAGCAGAAAT 238 　CTGACCTTAAGTTGTTCTTCCAAAGCAG 　 17GACTTTCGATGTTGAGATTACTTTCCC 416 　AAGCTTGAGATGCTCTCACCTTTTCC 　 19TTCTACCACATCCCATTTTCTTCCA 459 　GATGGCAAAAGTGTTGAGAAAAAGTC 　 43GAACATGTCAAAGTCACTGGACTTCATGG 357 　ATATATGTGTTACCTACCCTTGTCGGTCC 　 44CTTGATCCATATGCTTTTACCTGCA 268 　TCCATCACCCTTCAGAACCTGATCT 　 45AAACATGGAACATCCTTGTGGGGAC 547 上CATTCCTATTAGATCTGTCGCCCTAC 　 47CGTTHTTHCSTTTHTCTHTTTCAGTTAC 181 　GTCTAACCTTTATCCACTGGAGATTTG 　 48TTGAATACATTGGTTAAATCCCAACATG 506 　CCTGAATAAAGTCTTCCTTACCACAC 　 49GTGCCCTTATGTACCAGGCAGAAATTG 439 　GCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 　 50CACCAAATGGATTAAGATGTTCATGAAT 271 　TCTCTCTCACCCAGTCATCACTTCATAG 　 51GAAATTGGCTCTTTAGCTTGTGTTTC 388 　GGAGAGTAAAGTGATTGGTGGAAAATC 　 52AATGCAGGATTTGGAACAGAGGCGTCC 113 　TTCGATCCGTAATGATTGTTCTAGCCTC 　 60AGGAGAAATTGCGCCTCTGAAAGAGAACG 139 　CTGCAGAAGCTTCCATCTGGTGTTCAGG 　

( 二)单个碱基置换的检测 　　单碱是置换在DMD/BMD的发生中占有重要地位，但DMD/BMD是因单碱基置换近年来才受到人们的重视，它对发现新突变，确定单碱基置换与DMD/BMD发生的关系具有重要意义，推测的方法主要是用RT-PCR -SSCP及全套式RF-PCR 检测.

( 三)利用PCR -RFLP和Amp-FLP进行连锁分析诊断DMD/BMD 　　若在一个家庭中，已有一个先证者，则首先利用多重PCR 检测其缺失，若不能确定其缺失的部位或不能诊断，或其它条件所限，则可用PCR -RFLP和Amp-FLP进行连锁分析，确定风险染色体. 　　1.PCR -RFLP 　　用多重PCR 不能检出非缺失型DMD/BMD患者及携带者，现在可用PCR 方法扩增多态性位点区域，同适当的内切酶酶解扩增产物，电泳分离后可对多态性位点进行分布，利用PCR -RFLP连锁分析，即可进行DMD/BMD风险个体的携带者的检出，下表序列即为常用的几个多态性位点检测时的引物及扩增酶解情况.

扩增区域 引物序列 限制性酶 扩增产物 水解片段PERT87-1 5'GTCAGTTGGTCAGTAAAAGCC3' B5＋NⅠ 400bp 400/250＋150 PERT87-8 5'CCAATTAAAACCACAGCAG3' TaqⅠ 155bp 145＋10/74＋71＋10 pERT87-15 5'GACTGGAGCAAGGGTCGCC3' XmaⅠ 740bp 730＋10/520＋210＋10 PERT87-15 5'ACAATTTCCCTTTCATTCCAG3' BamHⅠ 226bp 216＋10/166＋50＋10 MPIP 5'TCCAGTAACGGAAAGTGC3' AluⅠ 60bp 60/56or52 841Q 5'ATAATTCTGAATAGTCACAAAAG3' MaeⅢ 252bp 236＋16/128＋108＋16 　　2.AmP-FLP 　　在DMD/BMD基因区内有多个(CA)n重复区域，这些区域可用OCR方法进行扩增，增产物同聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行分析扩增片段大小，然后与先证者及母亲进行对比，亦是检出患者与携带者的理想多态性标记，现将在我国人群中已作分析的(CA)n区引物及多态性片段，PIC列表示下: 位置 名称 等位基因 引物序列 片段 PIC 5'脑组织特异启动子 DYS-Ⅱ 8F5'TCTTGATATATAGGGATTATTTGTGTTTGTTATAC 214-218 0.750 　 　 　R5'ATTATGAAACTATAAGGAATAACTCATTTAGC 3'非翻译区 3'CA 4F5'GAAAGATTGTAAACTAAAGTGTGC 119-137 0.375 　 　 　R5'GGATGCAAAACAATGCGCTGCCTC 内含子 44CA 9F5'TCCAACATTGGAAATCACATTTCAA 174-204 0.072 　 　 　R5'TCATCACAAATAGATGTTTCACAG 　 45CA 7F5'GAGGCTATAATTCTTTAACTTTGGC 156-184 0.772 　 　 　R5'CTCTTTCCCTCTTTATTCATGTTAC 49CA 11 F5'CGTTTACCAGCTCAA ATCTCAAC 227-257 0.870 　 　 　 R5'CATATGATACGATTC GTGTTTTGC 　 50CA 4 F5'AAGGTTCCTCCAGTA ACAGATTTGG 233-251 0.718 　 　 　 R5'TATGCTACATAGTAT GTCCTCAGAC 　　不应用内含子进行连锁分析时，可用44/49，45/50两组双重PCR 同时扩增，亦可在这些组中，将缺失热点的引物加入，形成多复PCR ，连锁分机与缺失检测同时进行. 五、DMD/BMD的PCR 快速前诊断 　　过去DMD/BMD的PCR 快速产前基因诊断主要采用RFLP连锁分析，由于该方法探作复杂费时，提供的信息量有限，因此不能满足临床诊断的要求，目前主要应用PCR 法进行产前诊断.

产前快速基因诊断常用以下两种途径 　　1.四步法: 　　(1)性别确定.━━(SRY引物＋DMD课题内对照) 　　(2)先证者缺失型基因检测(多重PCR ) 　　(3)胎儿缺失型的确定(多重PCR ＋单对引物PCR ) 　　(4)Amp-FLP＋PCR -RFLP确定非缺失型式携带者 　　2.一步列位法:董尚志等人在上述方法的基础上建立了一步到位快速法，该系统包括以下三组多重PCR 体系. 　　①5'pmCA＋e12＋MP1P 　　②e17＋44CA＋49CA 　　③e17＋45CA＋50CA 　　应用上述三组多重PCR 不仅可将女性的两条×染色体分开.而且能检出染色体的.另有一组，SRr＋e44定胎儿性别及44外显子的缺失.一步到位法快速，方便，它不仅能检测缺失，亦可对非缺失型的DMD/BMD进行连锁分析. >