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变性梯度凝胶电泳(DGGE)实验操作技术方法与步骤

2024-11-20 蛋白质加入收藏

变性梯度凝胶电泳主要分离原理是利用DNA链的熔解性质达到分离目的，低熔点和高熔点的DNA局部解链的程度不同，分子的迁移速率不通过，进而分离。一、实验原理变性梯

变性梯度凝胶电泳主要分离原理是利用DNA链的熔解性质达到分离目的，低熔点和高熔点的DNA局部解链的程度不同，分子的迁移速率不通过，进而分离。

一、实验原理

变性梯度凝胶电泳 (DGGE)是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度(Tm)。Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60 ℃，变性剂0~100%。当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变，达到分离的效果。Tm的改变依赖于DNA序列，即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此，DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。

为了提高DGGE的突变检出率，可以人为地加入一个高熔点区——GC夹。GC夹(GC clamp)就是在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构，这样在PCR 产物的一侧可产生一个高熔点区，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。因此，DGGE的突变检出率可提高到接近于100%。

作为一种突变检测技术，DGGE具有如下的优点：(1)突变检出率高。DGGE的突变检出率为99%以上。(2)检测片段长度可达1kb，尤其适用于100~500bp的片段。(3)非同位素性。DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害。(4)操作简便、快速。DGGE一般在24小时内即可获得结果。(5)重复性好。但是，该方法需要特殊的仪器，而且合成带GC夹的引物也比较昂贵。

二、实验用品

1.PCR扩增仪;变性梯度凝胶电泳仪 ;凝胶成像及分析系统;紫外透射仪;高速离心机;电泳仪;电泳槽。

2.尿素、去离子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、琼脂糖

3.微量加样器(200μl，20μl);Tip头(200μl，20μl)。Tip头盒(200μl，20μl);Eppendorf管(0.5ml，0.2ml)，Eppendorf管架。

4.PCR扩增相关试剂

三、实验步骤

1.PCR反应(同前)

其中，上游引物加40bp [GC] Clamp。

2.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认。

3.垂直变性梯度凝胶电泳

变性梯度递增的方向与电泳方向垂直。所使用的胶为6%聚丙烯酰胺凝胶，变性浓度为0～100%。其中，含7 M尿素和40%去离子甲酰胺的胶为100%变性，不含尿素和去离子甲酰胺的胶为0%变性。垂直变性梯度凝胶电泳主要是检测引物的最适解链条件(即变性浓度)。

PCR产物加上样缓冲液后上样，300～400μl/孔，电压150V，温度60℃，时间2～4小时。