双向电泳的实验相关试剂配制

1．        Bradford 工作液 95%乙醇             25ml       先用乙醇溶解考马斯亮兰G250，溶解完后再加磷 85%磷酸             52ml       酸，最后超纯水定容至500ml。过滤后置于棕色瓶 考马斯亮兰G250      0.035g     外加油皮纸保存（Bradford不稳定，一周内有效） 2．        裂解液 尿素                 8M 硫脲                 2M CHAPS               4% DTT                 60 mM Tris―base            40 mM（如果有条件可以添加PMSF 0.5mM和5%的Pharmalate） 3.        水化液储液 尿素                 8M 硫脲                 2M CHAPS               4% Tris―base            40 mM 4.        分离胶buffer (pH8.8)                         250ml SDS                  0.4%                   1g Tris―HCl             1.5M                 45.4275g 5.        浓缩胶buffer (pH6.8)                         100ml SDS                  0.4%                  0.4g Tris―HCl             0.5M                  6.07g 6.        凝胶储存液（30%的丙烯酰胺）               250ml Acr                  29.2%                  73g Bis                   0.8%                   2g 7.        电极缓冲液（跑一次要配制2500ml） 甘氨酸               43.2g                  36g Tris                  9g         或           7.5g SDS                 3g                     2.5g                超纯水定容至3000ml                         超纯水定容至2500ml 8．        0.5M Tris ―HCl pH 6.8储液 6.1g Tris先用30ml超纯水溶解，再用46ml，3M HCl调pH6.8,再加水定容至100ml 9．        平衡液储液 脲（即尿素）         36g 甘油                 30%                  30ml SDS                  1%                   1g 0.5M Tris―HCl pH6.8  10ml              超纯水定容至100ml 10. 平衡液A（一根胶条） DTT                 20mg 平衡液储液           10ml 11．平衡液B（一根胶条） 碘乙酰氨             300mg 平衡液储液           10ml 0.05%溴酚兰          15ul              (平衡液A、B均需临时配制) 12．0.5%琼脂糖10ml 琼脂糖               0.05g 电极缓冲液           10ml 溴酚兰               25ul 补：4、5、6的溶液需过滤后储存于4OC备用。 C．        药品 CHAPS          兼性离子去垢剂    去垢剂可破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用， SDS            离子型去垢剂       提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出 尿素            离液剂             可改变或破坏氢键等次级键的结构，使蛋白质 硫脲            离液剂             变性并使蛋白失活。尿素和硫脲联合使用，可                                    以大大增加蛋白质的溶解性 DTT            还原剂             断裂蛋白质分子中Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解性。但过分提高DTT的浓度，由于它pKa在8左右，因而会影响pH梯度。DTT在碱性pH下会去质子化，等电聚焦时会损耗，导致二硫键复原，蛋白质沉淀 BSA                               Bradford中制作标准曲线用 无水乙醇                           和磷酸一起，提供Bradford中的环境 磷酸                               提供Bradford中的酸性环境 Tris                                构成缓冲液的成分，可用于抗衡pH的变化 IPG buffer 覆盖液                             即矿物油，防止水分蒸发，样品干燥。 丙烯酰胺（Acr）                     以丙烯酰胺为单体，甲叉二丙烯酰胺为交联剂， 甲叉二丙烯酰胺 （Bis）              在催化剂（Aps）和引发剂（TEMED）作用下，聚合交联成三维网状结构 琼脂糖 溴酚兰                            指示剂作用 碘乙酰氨（IAA）                   平衡液B中使用，中和A液中的DTT 正丁醇                          比聚丙烯酰胺密度小，用于凝胶制作过程中的压胶 甘油                               无机盐的良好溶剂，热稳定性好 Marker 考马斯亮兰G250（Bradford法用）    考马斯亮兰G250有红、蓝两种不同颜色的形式在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定，反应化合物在465~595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色 深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量 甘氨酸                             与Tris构成缓冲系统 AgNO3 EDTA                              金属螯合剂，可以结合银离子，终止银染过程