百奇生物的Western-Blotting方法

1. 溶液准备：

转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.192 M甘氨酸 , 30%甲醇

10×TBST:250mM Tris-HCl （ pH 8.0 ） , 1.25M NaCl , 0.5%Tween20

封闭液：1×TBST , 3%脱脂奶粉

洗涤液：1×TBST

2. 实验程序：

A. 膜的准备：

将PVDF膜切成条浸在甲醇中，室温条件下在摇床上摇1min,去除甲醇后加入1×TBST备用。

B. 膜转印：

1. 细胞或组织裂解液进行SDS-PAGE电泳

2. 用夹心法电转至PVDF膜

3. 海绵和滤纸浸泡在转印缓冲液预湿润

4. 在半干转印系统中10v转印2h,封闭液室温封闭1h或者4℃过夜。

C. 抗体检测：

1. 将一抗溶解于3ml封闭液中，终浓度为4μg/ml,4℃孵育过夜。

2. 用洗涤液洗涤3次，每次5min.

3. 用封闭液来稀释二抗（HRP标记的抗兔或抗鼠），室温下培育1h.

4. 用洗涤液洗涤3次，每次5min.

5. 用化学发光底物检测。