被科学家埋没了20年的绿色荧光蛋白

近年来，绿色荧光蛋白 的研究越来越受到科研工作者的重视和看好，相关的成果不断见诸各个期刊。今年头中科院生物物理所就联合北京大学通过实验获得了一系列的绿色荧光蛋白。那么，绿色荧光蛋白的前世今生有怎样的故事呢?

2008年10月8日，诺贝尔化学奖揭晓。日本科学家下村修、美国科学家马丁•查尔非和钱永健因发现和改造绿色荧光蛋白(GFP)而获奖。GFP大家都不陌生，细胞中散发着点点绿光，煞是好看。1962年被发现，1992年被克隆 ，中间隔了30年。而它在生物界中被广泛应用，也就是这十几年的事。GFP到底有着怎样的前生今世?

让我们先来了解一些关于GFP的基本知识。GFP由238个氨基酸组成，分子 量为26.9 kDa，最初是从维多利亚多管发光水母中分离出来的，在蓝光照射下会发出绿色荧光。来源于水母的野生型GFP在395 nm和475 nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509 nm，处于可见光谱的绿色区域(图1)。来源于海肾的GFP只在498 nm有单个激发峰。

GFP是典型的β桶形结构，包含β折叠和α螺旋，将荧光基团包含在其中(图2)。严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱导Ser65–Tyr66–Gly67三肽环化，导致荧光基团形成。

1962年，下村修和约翰森从维多利亚多管水母(Aequorea victoria)中分离生物发光蛋白-水母素(aequorin)时，意外地得到了一个副产物。它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下发强烈绿色。其后他们仔细研究了其发光特性。1974年，他们得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白、以后称绿色荧光蛋白 (GFP)。GFP在水母中之所以能发光，是因为水母素和GFP之间发生了能量转移。水母素在钙刺激下发光，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。这是物理化学中已知的荧光共振能量转移(FRET)在生物中的发现。

研究者们并没有意识到GFP的应用前景，慢慢就将其遗忘了。这一晃就是20年。直到1992年，道格拉斯•普瑞舍克隆并测序了野生型的GFP，文章发表在《Gene》杂志上。但具有讽刺意味的是，基金评审委员会认为普瑞舍的工作没有意义，不愿提供经费。普瑞舍一气之下，离开了科学界，将GFP的 cDNA送给了几个实验室。很多人尝试用GFP的基因来表达蛋白，但都失败了。马丁•查尔非就考虑只用它的编码区域来表达。他用PCR的方法扩增了GFP 的编码区，将它克隆到表达载体 中，通过UV或蓝光激发，在大肠杆菌和线虫细胞内均产生了很美妙的绿色荧光。这才是GFP作为荧光指示剂的真正突破，文章发表在《Science》杂志上。

尽管野生型GFP发出很绚丽的荧光，但它还是有不少缺点，比如有两个激发峰、光稳定性不好，在37℃不能正确折叠。

1996年Remington小组最先在《Science》上发布了GFP的S65T突变体的晶体结构。一个月后，Phillips小组也在《Nature Biotech》上发布了野生型的GFP结构。正是这些晶体结构的探明，才使人们更好地了解发光基团的组成，以及与周围残基的相互作用。研究人员通过定点或随机突变，不断地改造这些残基，得到了我们今天使用的GFP衍生物。

首个重大改变就是钱永健在1995年完成的单点突变(S65T)。这个突变显著提高了GFP的光谱性质，荧光强度和光稳定性也大大增强。突变后的 GFP激发峰转移至488 nm，而发射峰仍保持在509 nm，这和常用的FITC滤光片匹配，提高了GFP的应用潜力。而F64L点突变则改善了GFP在37℃的折叠能力，综上就产生了增强型GFP，也就是我们常见的EGFP。

其他的突变还包括颜色突变，这其中大部分也是钱永健的功劳。现在有蓝色荧光蛋白(EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1)、青色荧光蛋白(ECFP, Cerulean, CyPet)和黄色荧光蛋白(YFP, Citrine, Venus, Ypet)。蓝色荧光蛋白除mKalama1外，都包含Y66H替换。青色荧光蛋白则主要包含Y66W替换。YFP衍生物是由T203Y突变实现的。另外，还有对pH敏感的突变体如pHluorins。

荧光蛋白广泛应用于生物学研究。通过常规的基因操纵手段，将荧光蛋白用来标记其他目标蛋白，这样可以观察、跟踪目标蛋白的时间、空间变化，提供了以前不能达到的时间和空间分辨率，而且可以在活细胞、甚至活体动物中观察到一些分子。荧光蛋白技术也使得人们可以研究某些分子的活性，而不仅仅是其存在与否。

具有荧光蛋白的昆虫

1997年7月日本大阪大学的科研人员首次培育出能够夜里发光的含有绿色荧光蛋白的老鼠

含有绿色荧光蛋白的兔子

从1974年发现绿色荧光蛋白在水母中发光的20年后，绿色荧光蛋白的应用前景才重新被重视，1996年两个科研小组发布了绿色荧光蛋白的晶体结构，还有钱永健对其的颜色突变研究，绿色荧光蛋白的用途真正被熟知。