Western bloting 综述

摘要：本文主要是针对Western bloting的原理及操作进行了简单的阐述，Western印迹法是利用抗原抗体的免疫反应，先将蛋白通过SDS-PAGE电泳分离开来，然后再利用电场力的作用将胶上的蛋白转移到固相载体（NC膜）上，然后再加抗体形成抗原抗体复合物，利用发光或显色原理将结果显示到膜或底片上。同时对Western bloting在实际操作中应注意的细节问题进行了归纳以及与其它免疫技术就抗体检测方面进行了比较。 关键词：Western bloting；免疫；转膜；显色；抗体 印迹法(bloting)是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质印迹分析称为Western印迹法（Western bloting），对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。 一、        Western bloting的原理     Western bloting首先是要将电泳后分离的蛋白从凝胶中转移到NC膜上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上，在凝胶上放一片NC膜，再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好，缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到NC膜上，NC膜可以与蛋白质通过疏水作用产生不可逆的结合。但是这种方法转移效率低，通常只能转移凝胶中的一小部分蛋白质（10%-20%）。而电泳印迹可以更快速有效的进行转移。这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和NC膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质在电场力的作用下离开凝胶结合到NC膜上。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。半干转移，用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。与湿转相比，这种方法要快（15-45 分钟）。 转移后的NC膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液（如10%的BSA或脱脂奶粉溶液）处理以封闭NC膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。目前有结合各种标记物的抗体特定IgG的抗体（二抗）可以直接购买，最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）。碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐（BCIP）转化为蓝色的产物；而辣根过氧化物酶可以将H2O2为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产物。另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺并发光，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测出辣根过氧化物酶的存在，即目标蛋白质的存在了。除了酶连二抗作为指示剂，也可以使用其它指示剂，比如：荧光素异硫氰酸盐标记的二抗（可通过紫外灯产生荧光）；生物素结合的二抗等等。 除了使用抗体或蛋白作为检测特定蛋白的探针以外，有时也使用其它探针如放射性标记的DNA，可以检测印迹中的DNA结合蛋白。 在Western bloting实验中，有另一种方法，就是直接标记一抗，再用底物显色。这种方法叫直接法，与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记二抗可用于很多种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不止一个二抗分子，所以二抗可以增强信号。所以一般情况下都�用间接法进行检测。 二、        Western bloting的操作(间接法) 1、        蛋白质样品（抗原）的制备： ①  细胞的处理方法：向收集到的细胞中加入RIPA裂解缓冲液（三中蛋白酶抑制在使用前加入，终浓度为2ug/ml）在冰上裂解30―60min，然后再插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次，再离心12000rpm3-5min，吸取上清备用。（超声强度不能过大，防止蛋白碳化） 组织的处理方法：按实验要求将组织从动物体内取出（样品不宜反复冻融），取少量（1-2g左右）放入玻璃匀桨器中研磨成匀浆，然后转入EP管中进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次5-7秒，重复5-6次，再离心12000rpm3-5min，吸取上清备用。 ②上述两种方法得来的样品处理液还要加入1/4体积左右的上样Buffer，然后放在沸水浴中加热3-4min使蛋白变性，方可作为样品点样。（注意：在加热组织裂解液时，肝脏和肾脏组织要特别注意其本身浓度，最好是在制作裂解液时就适当稀释，否则加热后会凝结成固态。还有些组织处理后很粘稠，有带丝状物，这是未裂解的核酸，可以适当离心后再用。） 2、        SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE） ①根据要求配制好SDS-聚丙烯酸胺凝胶（一般�用10%的SDS－PAGE） ②将已配制好的凝胶装入电泳仪中（注意不要漏液）。 ③设计加样顺序，作好实验记录，按预定顺序加样。一般裂解液我们按10-20ul/道点样，重组蛋白按1-2ug/道点样。 ④把电泳装置与电源连接好，将电压调至100V电泳10-20min，待溴酚蓝迁移出积层胶位置再换用200V，30-40min后关闭电源。 ⑤从电泳装置上卸下凝胶玻璃板，用水冲洗干净，准备转膜。 4．转膜（湿转） ① 将凝胶玻璃板置于盛有电泳转移缓冲液的容器中，浸泡几分钟。 ② 带上手套，准备好滤纸和NC膜（83mm×75mm），尽量避免污染滤纸和膜，将裁减好的滤纸和膜浸泡与电泳转移缓冲液中，驱除留于膜上的气泡。 ③ 打开转移盒并放置浅盘中，用转移缓冲液将海绵垫完全浸透后将其放在转移盒壁上，海绵上再放置一张浸湿的滤纸。 ④ 按“海绵―滤纸―凝胶―NC膜―滤纸―海绵”的顺序装置好（注意不能有气泡且装置电极槽不能放反） ⑤将冰盒装入缓冲液槽，注满4℃预冷的转移缓冲液。 ⑥将整个装置放在冰浴中用磁力搅拌器搅拌，连接好转移电极恒流300mA转移90min。电转完毕后，将NC膜作好记号置于5%的脱脂奶粉（PBS配制）中封闭，37℃2小时或4℃过夜。 5．加一抗与抗原结合 ①将加样槽洗涤干净，将膜用一次性手套覆盖好，按标记和实验设计切下膜条并作好记号，按顺序置于加样槽中加入相应的一抗约1ml，注意保证膜的所有部分同溶液接触。 ②室温下于摇床孵育2h或4℃过夜。 ③弃去一抗，膜条仍置于加样槽，每个槽中的膜用PBST在摇床洗涤洗涤5min左右 ，换液，反复4-5次。 6．加二抗与一抗的结合 ① 根据实验需要和设计选择合适的酶标二抗和稀释浓度（PBS稀释），每个加样槽中加入二抗1ml左右室温下于摇床孵育1h，注意保证膜的所有部分同溶液接触。 ②弃去二抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加PBST在摇床洗涤洗涤5min左右，换液反复4-5次。 7．显色反应（重组蛋白一般用AP显色或是DAB显色，裂解液一般用发光法） ① HRP标记二抗用DAB显色，按顺序依次将DAB三种剂各取3滴于5ml蒸馏水中，避光混匀，将膜加入显色液中避光显色5-15min终止反应，对照Marker记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存 ②        AKP标记二抗用AP显色，在10mlAKP缓冲液中加入66µlNBT溶液和33µl BCIP溶液混匀，室温下将膜放入显色（37℃可加速反应）5-15min。对照Marker记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存。 ③底物发光法：将两种显色底物1：1等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面（时间根据光的亮度来衡量），显影、定影。（荧光在一段时间后会越来越弱要控制好时间） 三、Western bloting要注意的一些问题 1、为了让实验更加严谨有说服力都要设计对照实验，对照分为：阳性对照（最好有标准品（比如β-actin，GAPDH）或阳性血清）；阴性对照（测血时用相应小鼠未免疫血清（即正常血）；空白对照（不加一抗，用PBS代替）；无关对照（用无关抗体） 2、一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景的深浅。 3、实验设计时所�用的抗原批次要一样，尽量的避免人为的带来个体差异。特别在做裂解液时更要注意所�用的操作条件，尽可能的排除可变因素给实验带来不确定性。 4、凝胶的质量直接影响以后的实验结果，要特别注意几点：凝胶要均一没有气泡；积层胶与分离胶界面要水平；AP和TEMED的量不能过多，太多会导致胶易脆裂；拔梳子时要快，尽量保证点样孔平整。 5、电泳、转膜时特别要注意正负极，电压电流都不能过高；转膜时“三明治”的叠放次序不错，同时要防止产生气泡；尽量让电转温度保持在10度以下，冰浴为宜。 6、封闭时一般在室温下2h就够了，但是要注意如果是生物素标记的二抗就不宜用牛奶，因为牛奶中含有生物素，用BSA效果更好。 7、加一抗二抗要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；还要注意一抗二抗的匹配。 8、在显色发光时要特别注意二抗所对应的显色方法，特别是在发光时要注意发光时间和显影时间的控制，以看得清楚目的条带为标准。 四、Western bloting在抗体生产中的应用      Western bloting是用来对蛋白质进行检测的一种常用方法，通过抗原抗体的免疫反应可以定量测出抗体的相对分子量，以及抗体的相对丰度或与已知抗原的关系等等。目前它应用在多个领域,在临床上检测传染病和自身免疫病、过敏症等，在抗体生产领域它与ELISA、ICC、IHC、IFA等免疫技术相接合已成为单克隆抗体生产的主要筛选手段。      在单抗的筛选过程中通常�用几中免疫技术并存的方式进行筛选，针对不同的抗体�用不同的技术，有利于提搞抗体生产的筛选效率，下面就针对几种常用的方法与Western blot进行比较： 方法        ELISA        WB        IHC/ICC        免疫荧光（IFA） 操作        简单，周期短        复杂，周期长        较简单        较简单（要专门的荧光显微镜） 灵敏度        高，易产生假阳性        高，特异性高        较WB低        较ICC高 交叉        有.        有，易识别（根据抗原分子的大小）        有，难识别        有 准确度        定性        定性定分子量        定位        定位 载体        酶标板        凝胶、膜        玻片        玻片 结果        普通显色        化学化光/普通显色        普通显色        荧光 在抗体检测中Western bloting经常要注意到目标抗体与抗原（细胞/组织裂解液）的接合能力，特别是交叉现象，所以一定要设置好对照实验。同时还有测血、测母克隆亚克隆过程中一定要注意抗体的稀释倍数以及二抗的使用等等。 总而言之，做Wetern bloting实验熟练撑握原理和操作是前提，关键是统筹整个实验流程，合理安排，注意细节，这样才能保证实验的高效性和准确性。