L-乳酸脱氢酶测定实验-分光光度计法测定还原反应

乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）广泛存在于生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一。LDH可溶于水或稀盐溶液。组织中LDH含量测定方法很多，其中紫外分光光度法更为简单、快速。鉴于NADH，NAD+在340nm及260nm处有各自的最大吸收峰，因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值的改变，定量测定酶的含量。

材料与仪器

步骤

一、试剂：

0.1 mol/l 磷酸钾 pH 7.0

0.01 mol/l NADH（71 mg 溶于10 ml H2O 中）

0.1mol/l 丙酮酸（丙酮酸钠，Mr＝110；110 mg溶于10 ml H2O 中）。

LDH 原料溶液（从猪心脏提取，例如 10 mg/ml，用 0.1 mol/l 磷酸钾 pH 7.0 稀释至 1 IU/ml）

二、LDH活力测定

1. 取1只比色杯中加入0.1 m mol/L pH7.5 磷酸氢二钾缓冲液3ml，置于紫外分光光度计中，在340nm处将光吸收调节至零。

2. 取1只比色杯，依次加入丙酮酸钠溶液2.9ml，NADH溶液0.1ml，加盖摇匀后，加入经稀释的酶液10μl，加盖摇匀后，在A340nm，连续测定3min，以A对时间作图，取反应最初线性部分，计算A340nm/min减少值。

三、数据处理

计算每毫升组织提取液中LDH活力单位。

注意事项