猪卵母细胞冻存保存方法

冻存（cryopreservation）是生物材料保存的主要方法之一。利用冻存技术将胚胎、配子或卵巢置于 -196 ℃ 液氮中低温保存，可以使胚胎、配子或卵巢暂时脱离生长状态而将其生理特性保存起来，这样在需要的时候再复苏用于实验。适度地保存一定量的胚胎、配子或卵巢，可以防止因意外事件而造成丢种，起到了胚胎、配子或卵巢的保种作用。除此之外，还可以利用冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些特殊基因型的胚胎、配子或卵巢。

原理

冻存技术的原理是加入保护剂，如终浓度 5％～15％ 的甘油或二甲亚砜（DMSO），可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用「慢冻快融」的方法能较好地保证胚胎、配子或卵巢的存活。

材料与仪器

器材：

① 冻存管

② 无菌移液枪、枪头

③ 超低温冰箱

④ 玻璃微细管

⑤ 开放式拉长麦管

⑥ 凝胶上样管

⑦ 维纳斯剪刀

试剂：

① 材料：大鼠

② 含 10％ FCS 的 TCM199 或 PBS

③ EFS40，EFS30，GFS40，EDFS

④ 液氮

⑤ DMSO

⑥ 丙三醇

⑦ 盐酸肾上腺素

步骤

一、猪卵巢冻存的基本方法有如下几种：

（一）OPS（open pulled straw）法

1. 将 GV 期或 MII 期卵母细胞经 TCM199 清洗后，转移到预处理液 1 中，平衡 5 分钟，再转移到数个约 100 μl 的 EFS40 小滴中，每滴约含卵母细胞 16 枚，然后平衡 1 分钟。

2. 利用虹吸或注射器吸入麦管，然后直接投入到 -196 ℃ 液氮中。

（二）GMP（glass micropipette）法

1.GMP 管由直径为 0.30 cm 左右的玻璃管在酒精灯外焰上加热煅烧，拉制成外径约为 0.3 mm 的微管。

2. 卵母细胞经 M199 清洗后，先在预处理液 I 中平衡。

3. 平衡完后，玻璃化液滴中，每滴约 12 枚卵母细胞，并平衡 1 分钟。

4. 在平衡过程中装管。在将卵母细胞吸人 GMP 管时，若卵母细胞全部吸入，可不吸入剩余的冷冻液并尽量使冷冻液和卵母细胞位于拉细的部分，以保证卵母细胞周围含尽量少的抗冷冻剂。

5. 装管完成后，直接投入到 -196 ℃ 液氮。

（三）GLT（gel-loading tip）法

1. 卵母细胞进行随机分组后，转移到预先在 37 ℃ 恒温台上平衡的预处理液中，平衡 5 分钟，再转到玻璃化冷冻液中。

2. 根据实验要求可控制再玻璃化液中的平衡时间。用做好标记的 GLT 分别吸入含玻璃化液卵母细胞，每管约 12 枚细胞。

3. 放入小口袋中直接投入到 -196 ℃ 液氮。

二、猪卵母细胞的解冻过程

1. 实验前 2 小时调节室温及预先 37 ℃ 平衡解冻液，从液氮中取出冷冻管，在 37 ℃ 水浴中晃动 10 秒，立即取出拭去水珠，将内容物吹出于表面皿中的解冻液 I 中。

2. 转入新鲜的蔗糖溶液中平衡 5 分钟，再转入到解冻液 II 中平衡 5 分钟。

3. 在 TCM 199 液平衡 10 分钟，以充分洗去冷冻保护剂。

4. 将卵母细胞放入 CO2 培养箱中培养，条件 39 ℃、5％ CO2、饱和湿度，待检测或体外受精。