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DNA实验

焦磷酸测序

2024-05-18 DNA实验 加入收藏
简介焦磷酸测序 (pyrosequencing) 是一种基于发光法测定焦磷酸 (PPi) 的测序技术。焦磷酸测序技术的三个关键点分别是:①反应中使用 dATP


简介

焦磷酸测序 (pyrosequencing) 是一种基于发光法测定焦磷酸 (PPi) 的测序技术。焦磷酸测序技术的三个关键点分别是:


①反应中使用 dATP 的类似物 dATPaS,因为 dATP 的结构与 ATP 相似,能与荧光素反应发出荧光,而 dATPαS 几乎不产生背景荧光。


②反应中三磷酸腺苷双磷酸酶使测序能循环进行,因为每加一种 dNTP 时必须除去上一次未反应的 dNTP,否则会影响连续测序。这种双磷酸酶能够在聚合反应完成后降解剩余的 dNTP,因此无需用分离或洗涤步骤来除去剩余的 dNTP。


③使测序信号形成峰。由于测序反应产生的 ATP 信号会使背景累积而溢出,从而使测序无法进行,然而,用于降解 dNTP 的三磷酸腺苷双磷酸酶同时也能降解 ATP,因此可以得到峰信号。


方法原理


焦磷酸测序 (pyrosequencing) 的基本原理是:


①一条特异性测序引物与单链模板 DNA 退火后,加入酶混合物和底物混合物,其中酶混合物中包括 DNA 聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase);底物混合物中包括 5'-磷酸化硫酸腺苷(adenosine 5'-sul-phatophosphate,APS)和荧光素。


②向反应体系中加入 1 种 dNTP,如果它和 DNA 模板的下一个碱基配对,则会在 DNA 聚合酶的作用下,添加到测序引物的 3'-末端,同时释放出一分子 PPi。


③在三磷酸腺苷硫酸化酶的作用下,生成的 PPi 与 APS 结合形成 ATP。在荧光素酶的催化下,ATP 与荧光素结合形成氧化荧光素,同时发光,最大波长约为 560nm,荧光信号强度(即检测峰值的高低)与聚合的 dNTP 个数呈正比。


④反应体系中剩余的 dNTP 和残留的 ATP 在三磷酸腺苷双磷酸酶的作用下发生降解。


⑤加入另一种 dNTP,重复第②~④步反应。通过这种循环反应,根据加入的 dNTP 类型和荧光信号强度(峰值的高低),就可实时读取模板 DNA 的准确核苷酸序列信息。

原理如图所示:

方法用途:

焦磷酸测序技术操作简单,结果准确,可用于单核苷酸多态性位点分析、等位基因频率测定、细菌和病毒等微生物的分型鉴定、CpG 甲基化分析、扫描与疾病相关基因序列中的点突变等领域。


材料与仪器

试剂:

DNA 模板、dNTP、引物


仪器:
测序仪


步骤

焦磷酸测序技术的基本过程有以下几步:


1. 一条特异性测序引物与单链模板 DNA 退火后,加入酶混合物和底物混合物,其中酶混合物中包括 DNA 聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶 (ATP sulfurylase 入荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶 (apyrase); 底物混合物中包括 5'- 磷酸化硫酸腺苷 (adenosine 5'-sul-phatophosphate, APS) 和荧光素。


2. 向反应体系中加入 1 种 dNTP , 如果它和 DNA 模板的下一个碱基配对,则会在 DNA 聚合酶的作用下,添加到测序引物的 3'- 末端,同时释放出一分子 PPi。


3. 在三磷酸腺苷硫酸化酶的作用下,生成的 PPi 与 APS 结合形成 ATP。在荧光素酶的催化下,ATP 与荧光素结合形成氧化荧光素,同时发光,最大波长约为 560nm , 荧光信号强度(即检测峰值的高低)与聚合的 dNTP 个数呈正比。


4. 反应体系中剩余的 dNTP 和残留的 ATP 在三磷酸腺苷双磷酸酶的作用下发生降解。


5. 加入另一种 dNTP , 重复第②-④步反应。通过这种循环反应,根据加入的 dNTP 类型和荧光信号强度(峰值的高低),就可实时读取模板 DNA 的准确核苷酸序列信息。


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