DNA实验

利用ENU诱变模式生物基因组

2024-05-18 DNA实验加入收藏

简介乙酰基亚硝基脲（N-ethyl-N-nitrosourea，ENU）是目前最常用的小鼠诱变剂，它是一种烷化剂，可以将其乙烷基转移到 DNA 碱基的氧原子或氮

简介

乙酰基亚硝基脲（N-ethyl-N-nitrosourea，ENU）是目前最常用的小鼠诱变剂，它是一种烷化剂，可以将其乙烷基转移到 DNA 碱基的氧原子或氮原子上，导致碱基错配或碱基置换。由于雄鼠生殖细胞的突变率及后代的数量远远大于母鼠，故一般用 ENU 处理雄鼠。突变率最高的是有丝分裂前的精原干细胞，单个位点的突变率可以达到 (6 - 1.5~undefined103，相当于筛选 175 - 655 个配子可以获得一个目的基因的突变。ENU 主要修饰 A/T 碱基对，大约 44% 为 A/T→T/A 颠换，38% 为 A/T→G/C 转换，8% 为 G/C→A/T 转换，3% 为 G/C→C/G 颠换，5% 为 A/T→C/G 转换，2% 为 G/C→T/A 转换。翻译成氨基酸序列，这些变化大约引起 64% 错义突变，10% 无义突变，26% 拼接错误。ENU 可用于诱变产生各种类型的突变基因，如完全失去功能的无义突变、部分功能丧失的亚等位基因、功能获得的显性突变等。

方法原理

利用 ENU 诱变模式生物基因组的基本原理是利用乙酰基亚硝基脲 (N-ethyl-N-nitrosourea,ENU) 将其乙烷基转移到 DNA 碱基的氧原子或氮原子上，导致碱基错配或碱基置换。由于雄鼠生殖细胞的突变率及后代的数量远远大于母鼠，故一般用 ENU 处理雄鼠。

ENU 主要修饰 A/T 碱基对，大约 44% 为 A/T→T/A 颠换，38% 为 A/T→G/C 转换，8% 为 G/C→A/T 转换，3% 为 G/C→C/G 颠换，5% 为 A/T→C/G 转换，2% 为 G/C→T/A 转换。翻译成氨基酸序列，这些变化大约引起 64% 错义突变，10% 无义突变，26% 拼接错误。ENU 可用于诱变产生各种类型的突变基因，如完全失去功能的无义突变、部分功能丧失的亚等位基因、功能获得的显性突变等。

方法用途

利用 ENU 诱变模式生物基因组常用于获得功能基因研究的新材料，同时又可以带来一个非常有价值的副产品，即获得人类遗传性疾病的新模型。新模型的研究开发能够导致新的药物作用靶点的发现，为开发新型药物打开了希望之门。

材料与仪器

试剂：

乙酰基亚硝基脲、小鼠、

仪器：

培养箱、通风橱、

步骤

利用 ENU 诱变模式生物基因组的基本过程可分为以下几步：

1. ENU 溶液的配制和稀释 ENU 对光线、湿度和 pH 十分敏感，每次注射前应溶解一个新包装 ENU，并用铝箔包封避光，溶解后 3 小时内注射。操作应该在通风柜内进行，操作者穿防毒衣，戴塑料手套、口罩防护。向含 ENU 的 ISOPAC 容器中直接用 18 G 针头和注射器注入 10 ml 的 95% 乙醇。用手掌温暖包装瓶，并轻轻摇动直到 ENU 完全溶解（约需 10 分钟），此时溶液应该是透明的黄色。再向包装瓶中注射 90 ml 磷酸-枸橼酸缓冲液，彻底混匀。如果要制备浓度更低的溶液，可以从 ENU 包装瓶中取出 50 ml 的 ENU 溶液，直接加入到 50 ml 灭活液中，2 小时后可以弃去。向余下的 ENU 溶液中注入 50 ml 的磷酸-枸橼酸缓冲液，即得到稀释 1 倍的 ENU 溶液。

2.ENU 溶液的浓度测定购买的 ENU 容器中的含量并不准确，必须根据经验确定每 1 份制备的 ENU 溶液的浓度。取 400:1 的 ENU 溶液加入一次性塑料杯，用磷酸－袧橡酸缓冲液将体积扩充到 2000:1, 同时在一次性塑料杯中用磷酸－拘橡酸缓冲液对 95% 乙醇进行 1:50 稀释（空白对照）。用分光光度计测定 398nm 的 ENU 溶液 OD 值。l mg/ml 的 ENU 溶液的 0D398 为 0.72。为了保证测量的准确性，还可以在波长范围 350 - 450nm 扫描 ENU 溶液。峰值应该在 398nm。

3. 以 ENU 注射小鼠根据实验目的和小鼠品系可以 1 次注射也可分次注射。注射需在通风柜内进行。雄性小鼠在注射前应完全成熟 (8 周龄以上）。分次注射应在每周的同一天进行，约需 3 周，最好从小鼠 8 - 9 周龄时开始注射。注射前对小鼠称重，根据小鼠体重确定注射剂量，每公斤体重可注射 100 mg，体积<l ml。不同品系的小鼠对 ENU 反应不同，因此会产生不同的突变率。为了最大限度地提高突变率，C57BU6 小鼠的注射量可以是 100 mg/kg 体重，每周腹腔注射 l 次，共 3 次；或者一次性注射 250 mg/kg 体重。由于乙醇的作用，注射后 30 分钟内动物会有些摇晃颤抖。注射 30 只小鼠大约需要 1 小时。

4.ENU 的灭活残余 ENU 溶液必须经灭活方可排放。ENU 在碱性环境中半寿期很短，可用 0.1 mol/L 碱性硫代硫酸钠灭活。实验过程中所有溅出的 ENU 溶液要用灭活液擦净；所有与 ENU 接触的器具要浸泡于灭活液；注射器、吸管中要吸入灭活液，处理完后包装在塑料袋中弃去。向 ISOPAC 容器内残存的 ENU 溶液中注入至少 50 ml 灭活液，放在通风柜内，暴露于光线至少 24 小时。已经灭活的 ENU 溶液收集于「危险化学品＂容器并登记。用水清洗剩下的 ISOPAC 容器，液体倒入「危险化学品」容器，然后弃去 ISOPAC 容器。小鼠在注射后应置于打开的通风柜中至少 24 小时，注射后 24 小时更换垫料，垫料装入放置有被灭活液饱和的吸水纸的塑料袋。

5. 小鼠交配以回收突变注射后的雄性小鼠在 10 - 12 周内是不育的。在注射后 8 - 10 周，将注射的雄性小鼠与雌性小鼠合笼，以观察生殖能力的恢复。根据研究需要设计交配（对显性突变和修饰性突变，设计每个小鼠回收约 50 个配子；对隐性突变，设计回收 30 个配子）。采用雄性轮转方式交配：雄性小鼠每周与 1 - 2 只新的雌性小鼠交配，持续 6 - 7 周直到获得足够数量的配子。

注意事项

ENU 属有毒试剂，应严格按照化学毒物防护要求操作。