通过PCR扩增在扩增DNA产物末端引入限制性核酸内切酶酶切位点

噬菌体 T4 DNA 连接酶 限制性内切核酸酶 靶 DNA
氯仿 EDTA 乙醇 酚 氯仿 乙酸钠 TE
琼脂糖凝胶 水浴箱

一、材料

1. 缓冲液与溶液

氯仿

EDTA ( 0.5 mol/L, pH 8.0)

乙醇

酚：氯仿（1:1，V/V)

乙酸钠（3 mol/L, pH 5.2)

TE ( pH 7.5)

2. 酶与缓冲液

噬菌体 T4 DNA 连接酶

限制性内切核酸酶

3. 凝胶

琼脂糖凝胶

4. 核酸与寡核苷酸

正向引物（20 μmol/L）与反向引物（20 μmol/L）溶于水中

靶 DNA

5. 载体

质粒 DNA 应用相应的限制性内切核酸酶消化和凝胶电泳纯化

6. 特殊设备

水浴箱

二、方法

1. 应用本方案的材料部分设计的正向与反向引物，分成 4 支相同的 50 μl 体积反应管进行 PCR 反应扩增靶片段。合并 4 个反应管的反应液，溶液中应含有 200~500 ng 的期望的扩增产物。

2. 如果 PCR 产物电泳检査含有多于一或两条扩增 DNA 条带，可通过低融点琼脂糖凝胶纯化扩增片段。如果不用凝胶电泳纯化，制备的 PCR 扩增 DNA 可用酚: 氯仿抽提，和 Cemricon-100 浓缩器超滤纯化。纯化后的扩增产物溶于 TE 中（pH 7.5)，浓度为 25 μg/ml。

3. 取约 100 ng 纯化后的 PCR 产物，在 20 μl 酶切反应体系中加入 1.0~2.0 单位的相应限制性内切核酸酶进行酶切消化。将反应液孵育在最适温度消化 1 h。

4. 消化结束后，用 H2O 调整反应混合液至 10 μl，加入 0.5 mol/L EDTA 至终浓度为 0.5 mol/L。将反应液用酚: 氯仿与氯仿各抽提一次。

5. 转移反应液上层水相至一个新的离心管中，加入 3 moI/L 乙酸钠（pH 5.2) 至终浓度为 0.3 mol/L，加入 2 倍体积的乙醇，在 0℃ 贮存 30 min。

6. 将离心管放置在微量离心机上 4℃ 高速离心 5 min，使 DNA 沉淀，弃上淸，然后用 70% 乙醇洗涤沉淀，溶液再离心，弃上清，将 DNA 沉淀物在空气中晾干数分钟。

7. 将 DNA 样品溶于 10 μl 水中。

8. 在一只微量离心管内，依次加入下列试剂，混合：

25 μg/ml 扩增靶 DNA                  1.0 μl

质粒 DNA                                   20 ng

10X 连接缓冲液                           1.0 μl

T4 DNA 连接酶                           1 单位

用 H2O 调整终反应体积为 10 μl 反应体系。

如果需要，可加入 ATP 至终浓度 1 mmol/L。

在定向克隆的连接反应液中，纯化后靶 DNA 与酶切后的质粒载体的摩尔比例应为 1:1。设置对照反应管，加入以上除了质粒 DNA 的所有试剂。

9. 将连接反应混合液试管在 16°C 水浴温育 4 h。

10. 将上述二支试管内的连接反应液样品各取 5 μl，用 10 μl 水稀释后，转化具有抗生素抗性的感受态大肠杆菌受体菌。将这种转化菌液涂布于含合适抗生素和 IPTG 与 X-gal 的培养基的平皿上。

11. 计算实验管与对照管在培养皿上的菌落数。挑取可能含有靶基因 DNA 插入片断的白色菌落进行培养扩增，抽提质粒 DNA，利用质粒多克隆位点内的插入外源 DNA 片段侧翼的酶切位点，用相应的限制性内切核酸酶进行酶切鉴定，也可以用菌落 PCR 予以鉴定。

在不同的实验中，蓝白斑的比例在 1:5 与 2:1 之间变动。

12. 通过琼脂糖凝胶电泳鉴定克隆 DNA 片段的大小 （利用适合的 DNA marker 分子量作对照）。

13. 利用 DNA 序列分析，限制性内切核酸酶图谱或 Southern 杂交进一步鉴定克隆的靶基因 DNA 片段的正确性。