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DNA实验

体外转录合成单链RNA探针

RNA
2024-05-20 DNA实验 加入收藏
原理制备特异性的单链 RNA 探针不仅比 DNA 探针更容易,在杂交反应中一般也比具相同比活性的 DNA 探针产生更强的信号,这可能是由于含有 RNA 的杂合链


原理

制备特异性的单链 RNA 探针不仅比 DNA 探针更容易,在杂交反应中一般也比具相同比活性的 DNA 探针产生更强的信号,这可能是由于含有 RNA 的杂合链固有的更高稳定性的缘故(Casey and Davidson 1977)。虽然 DNA 探针仍普遍地应用于 Northern 和 Southern 杂交,但当分析哺乳动物基因的转录时,放射性标记的 RNA 目前是首选探针。由于 RNA 酶 A 既耐用又容易控制,可用 RNA 酶 A 来消化 RNA-RNA 杂合体,而不必用特异性 S1 核酸酶来消化 DNA-RNA 杂合分子,RNA 酶 A 可在较宽的浓度范围内使用而不影响实验结果(Zirmetal. 1983; Mehonetal. 1984)。

材料与仪器

限制性内切核酸酶 RNA 聚合酶 胰腺 DNA 酶Ⅰ 模板 DNA
乙酸铵 牛血清白蛋白 DTT 乙醇 酚 氯仿 胎盘 RNA 酶抑制剂 醋酸钠 转录缓冲液 rNTP 溶液
琼脂糖凝胶 微量离心管 Sephadex G-50 离心柱 水浴

步骤

一、材料

1. 缓冲液与溶液

乙酸铵(10 mol/L)

牛血清白蛋白(2 mg/ml,组分 V,Sigma 公司)

DTT ( 1 mol/L)

乙醇

酚:氯仿(1:1,V/V)

胎盘 RNA 酶抑制剂(20 单位/μl)

醋酸钠(3 mol/L,pH 5.2)

10X 转录缓冲液(400 mmol/L Tris-Cl ( 37℃ 下 pH 7.5),60 mmol/L MgCl2,20 mmol/L 盐酸亚精胺(spermidine HCl ),50 mmol/L NaCl)

2. 酶与缓冲液

适当的限制性内切核酸酶

T3、T7 或 SP6 噬菌体依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶


无 RNA 酶的胰腺 DNA 酶Ⅰ (1 mg/ml)

3. 凝胶

琼脂糖凝胶(0.8%~1.0%)

4. 核酸与寡核苷酸

含 rATP、rCTP、和 rUTP 各 5 mmol/L 的 rNTP 溶液

rGTP ( 0.5 mmol/L)

模板 DNA



5. 放射性复合物

[α-32P] dNTP ( 10 mCi/ml,比活性 400~3000 Ci/mmol)

6. 专用设备

微量离心管(0.5 ml)

Sephadex G-50 离心柱,用 10 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)平衡

预热至 40℃ 的水浴

二、方法

1. 用适当的限制酶消化超螺旋质粒 DNA 制备 5 pmol 的线性模板 DNA。取一小份消化的 DNA (100 ng) 进行琼脂糖凝胶电泳分析。如有必要,再补加限制酶继续温育,直至不再残存痕量的未消化 DNA。

2. 如必须用产生 3' 突出端的限制酶如 PstI 或 SstI,则应用噬菌体 T4 DNA 聚合酶在四种 dNTP 的存在下处理消化的 DNA 片段,以除去产生的 3' 突出端。

3. 用酚: 氯仿抽提及用标准乙醇沉淀纯化模板 DNA。将 DNA 溶解于水,使其终浓度为 100 nmol/L ( 如 3kb 质粒为 200 μg/ml)。

4. 将下列前六种组分温育至室温,在一个灭菌的 0.5 ml 微量离心管中,室温下以下列顺序混合:

模板 DNA                      0.2 pmol(3 kb 质粒为 400 ng)

无 RNA 酶的水              加至 6 μl

5 mmol/L rNTP 浓液       2 μl

100 mmol/L DTT            2 μl

10X 转录缓冲液             2 μl

2 mg/ml 牛血清白蛋白    1 μl

10 mCi/ml [α-32P] rGTP  5 μl

( 比活性 400~3000 Ci/mmol)

轻弹管外壁以使各组分混合。然后加入:

胎盘 RNA 酶抑制剂(10 单位)                          1 μl

噬菌体依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶(约 10 单位)  1 μl

轻敲管壁外侧使反应物混合,离心 1~2s 以使所有液体沉降到管底。37℃(T3 和 T7 噬菌体依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶)或 40℃(SP6 噬菌体依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶)下温育反应物 1~2 h。

5. ( 任选)如需全长转录物,可加入 2 μl 0.5 mmol/L rGTP,在适宜该聚合酶的温度下再温育 60 min。

6. 加入 1 μl 1 mg/ml 无 RNA 酶的胰 DNA 酶 I 以终止体外转录反应。轻弹管外壁以混合各试剂。37℃ 温育反应混合物 15 min。

7. 加入 100 μl 无 RNA 酶的水,通过用酚: 氯仿抽提纯化 RNA。

8. 将水相转移至一个新的微量离心管,用下列三种方法中的任一方法将放射性标记的 RNA 与不需要的小分子 RNA 和 rNTP 分开:

(1) 用乙醇沉淀纯化 RNA

① 在水相中加入 30 μl 10 mol/L 醋酸铵,混匀后再加入 250 μl 用冰预冷的乙醇。置 于冰上 30 min 后,在微量离心机中 4℃ 下以最大速度离心 10 min 收集 RNA。

② 小心地尽量吸去其中的乙醇,然后将管子敞开口,放置于实验台上数分钟,使剩余的可见的乙醇挥发干净。把 RNA 重溶于 100 μl 无 RNA 酶的水中。

③ 加 2 倍体积冰预冷的乙醇至小管内,将 DNA 贮存于 -70℃ 备用。

(2) 通过离心柱层析纯化 RNA

① 将 Sephadex G-50 离心柱平衡于 10 mmol/L Tris-Cl 中(pH 7.5) 灭菌处理。

② 用离心柱层析纯化 RNA。

③ 将洗脱的 RNA 贮存于 -70℃ 以备用。

(3) 通过凝胶电泳纯化 RNA

① 准备中性聚丙烯酰胺凝胶。

② 在水相中加入适当的凝胶上样缓冲液,通过凝胶电泳纯化 RNA。

③ 通过放射性自显影定位 RNA。

④ 用挤碎和浸泡的方法从凝胶块中纯化 RNA。

⑤ 将 RNA 贮存于 -70℃ 备用。






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