用T4噬菌体DNA聚合酶标记双链DNA的3'端
材料与仪器限制性内切核酸酶 T4 噬菌体 DNA 聚合酶 模板 DNA醋酸氨 乙醇 酚 氯仿 T4 噬菌体 DNA 聚合酶缓冲液 dNTP 溶液Sephadex
材料与仪器
限制性内切核酸酶 T4 噬菌体 DNA 聚合酶 模板 DNA
醋酸氨 乙醇 酚 氯仿 T4 噬菌体 DNA 聚合酶缓冲液 dNTP 溶液
Sephadex G-50 离心柱 水浴
醋酸氨 乙醇 酚 氯仿 T4 噬菌体 DNA 聚合酶缓冲液 dNTP 溶液
Sephadex G-50 离心柱 水浴
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
醋酸氨(10 mol/L)
乙醇
酚:氯仿(1:1,V/V)
2. 酶和缓冲液
适当的限制性内切核酸酶
T4 噬菌体 DNA 聚合酶
10X T4 噬菌体 DNA 聚合酶缓冲液
3. 核酸和寡核苷酸
含三种来标记的 dNTP 溶液,浓度各为 2 mmol/L
含一种未标记的浓度为 2 mmol/L 的 dNTP 的溶液
模板 DNA ( 0.1~5 μg )
4. 放射性复合物
[α-32P] dNTP ( 10 mCi/ml,比活性为 800~3000 Ci/mmol)
5. 专用设备
Sephadex G-50 离心柱,用 TE ( pH 7.6) 平衡
预设定至 70℃ 的水浴
二、方法
1. 用产生平端或 3' 突出端的限制酶消化 0.1~5.0 μg 模板 DNA。
2. 用酚: 氯仿抽提及在 2.5 mol/L 乙酸铵的存在下用乙醇沉淀纯化 DNA。
3. 将 DNA 沉淀溶于:
10X T4 噬菌体 DNA 聚合酶缓冲液 2 μl
2 mmol/L 三种未标记的 dNTP 溶液 1 μl
10 mCi/ml [α-32P] dNTP
( 800~3000 Ci/mmol) 1 μl
T4 噬菌体 DNA 聚合酶(2.5 单位/μl) 1 μl
水 加至 20 μl
37℃ 温育 5 min。
4. 加入 1 μl 2 mmol/L 未标记的第四种 dNTP 溶液,继续温育 10 min。
5. 70℃ 加热 5 min 以终止反应。
6. 用 Sephadex G-50 离心柱层析或在 2.5 mol/L 乙酸铵的存在下进行两轮乙醇沉淀分离标记的 DNA 与未掺入的 dNTP。
1. 缓冲液和溶液
醋酸氨(10 mol/L)
乙醇
酚:氯仿(1:1,V/V)
2. 酶和缓冲液
适当的限制性内切核酸酶
T4 噬菌体 DNA 聚合酶
10X T4 噬菌体 DNA 聚合酶缓冲液
3. 核酸和寡核苷酸
含三种来标记的 dNTP 溶液,浓度各为 2 mmol/L
含一种未标记的浓度为 2 mmol/L 的 dNTP 的溶液
模板 DNA ( 0.1~5 μg )
4. 放射性复合物
[α-32P] dNTP ( 10 mCi/ml,比活性为 800~3000 Ci/mmol)
5. 专用设备
Sephadex G-50 离心柱,用 TE ( pH 7.6) 平衡
预设定至 70℃ 的水浴
二、方法
1. 用产生平端或 3' 突出端的限制酶消化 0.1~5.0 μg 模板 DNA。
2. 用酚: 氯仿抽提及在 2.5 mol/L 乙酸铵的存在下用乙醇沉淀纯化 DNA。
3. 将 DNA 沉淀溶于:
10X T4 噬菌体 DNA 聚合酶缓冲液 2 μl
2 mmol/L 三种未标记的 dNTP 溶液 1 μl
10 mCi/ml [α-32P] dNTP
( 800~3000 Ci/mmol) 1 μl
T4 噬菌体 DNA 聚合酶(2.5 单位/μl) 1 μl
水 加至 20 μl
37℃ 温育 5 min。
4. 加入 1 μl 2 mmol/L 未标记的第四种 dNTP 溶液,继续温育 10 min。
5. 70℃ 加热 5 min 以终止反应。
6. 用 Sephadex G-50 离心柱层析或在 2.5 mol/L 乙酸铵的存在下进行两轮乙醇沉淀分离标记的 DNA 与未掺入的 dNTP。