克隆心得—帮助新手快速做出克隆

本方法的核心部分是医科院基础所的生化脂蛋白组的吴刚老师所创，我在其基础上进行了一些改动，主要是DNA回收上采取了更简单的方法。（本方法最适用于双酶切制作片断并进行克隆 的情况。对于分步酶切制作片断，也可以使用本方法，但需要加倍起始酶切DNA的量。）

一、片断平移的克隆 （也适用于多片断连接）

简介：将用作载体的质粒A（制作大片断）酶切3μL ，要切出小片断的质粒B酶切7μL；琼脂糖回收胶电泳；切胶回收来自质粒A的大片段，和来自B的小片断，并回收到一管中；酚氯仿法回收DNA，酒精沉淀，干燥；加入8μL水、1μLligase Buffer、1μL ligase ，4℃过夜；次日转化涂板。

酶切

配置可酶切共10μL质粒的酶切反应体系（双酶切）：

（提示 在克隆 设计时尽量使用好切的内切酶<通常是效价高、便宜量大的酶>，且注意这两个酶有比较兼容的Buffer，即在这种公用Buffer中，两酶的效力变化不大<至少保持60%的活性>。酶切体系根据需要，可加入BSA。）

酶切体系

A质粒酶切－制作载体片断

公用Buffer 3μL

酶 I 1μL

酶 II 1μL

质粒 3μL

双蒸水 22μL

合计 30μL

B质粒酶切－制作插入片断

公用Buffer 7μL

酶 I 2μL

酶 II 2μL

质粒 7μL

双蒸水 52μL

合计 70μL

混匀

37℃，酶切3小时。

（提示 关于酶量的问题。通常的内切酶效价在10U/μL左右，3μL内切酶相当于30U，足够切10μL的质粒。因为通常小提质粒的浓度在200－600ng/μL，一般浓度达不到1μg/μL。根据1U酶切1μg质粒的原则，这一酶量是足够的。）

1%琼脂糖回收胶回收（碎胶、酚氯仿抽提法）