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DNA实验

比较分子生理基因组学 —cDNA阵列的异种杂交实验

cDNA
2024-05-20 DNA实验 加入收藏
材料与仪器步骤一、材料这里用到的所有化学试剂都为分子生物学等级，或者用它们最高纯度的等效物。所有的塑料和玻璃制品，包括瓶子和移液器吸头都要高压灭菌，在核酸实验操


材料与仪器

步骤

一、材料

这里用到的所有化学试剂都为分子生物学等级，或者用它们最高纯度的等效物。所有的塑料和玻璃制品，包括瓶子和移液器吸头都要高压灭菌，在核酸实验操作过程中必须始终戴手套。 cDNA A T L A S阵列从Clontech购得。人 19K cDNA 阵列从Ontario 癌症研究所购得。

1 总 RNA 的提取

（1）焦 碳 酸 二 乙 酯（DEPC) (Sigma-Aldrich， St. Louis, MO) 加人水中，终浓度为0 . 1 % 搅 拌 过 夜（> 1 2 h)，高压灭菌。吸头、管子和其他塑料或玻璃
制品可以购买无 RNase 的或者在 DEPC 水中搅拌过夜，去 除 RNase。这部分实验所有的溶液制备和 RNA 样本溶解都需要使用 DEPC 水 和 无 RNase 的塑料或玻璃制品。

（2）TRIzol 溶 液（Invitrogen， Carlsbad， CA)。

（3）氯 仿（Fisher Scientific, Fairlawn， NJ)。

（4）异 丙 醇（Fisher Scientific)。

（5）7 0 % 乙醇 。于 70 mL 无 水 乙 醇（Pharmco， Brookfield, CT) 中加人 30 mLDEPC 水 。

2 RNA 变性凝胶电泳

1 . 1 0 父 1 \ / 〇 ? 3 缓 冲 储 液 ： 2 0 〇 1 1 1 1 1 1 〇 1 / 1 ^ ] \ / [ 〇 ? 3 [ 3 - ( ] ^ 1 1 1 〇 印 1 1 〇 1 ^ 1 〇 ) ? 1 ：〇卩&1165111{〇 11记 acid], 50 mmol/L 乙酸钠， 10 mmol/L EDTA， pH 7。 2. 1 % (WVV) 琼脂糖甲醛变性胶：在一装有217 m L双蒸水的无菌烧瓶中溶解3g 琼脂糖，加 入 溴 化 乙 锭 （ EB， lfxg/mL)。将溶液置于55°C 的恒温箱中。在另外 一个无菌烧瓶中加入30 mL MOPS 10 X 缓 冲 液 和 53 mL 3 7 % 甲 醛 溶 液 （ V./VO 后 ，置 于 55°C 。当两种溶液都稳定在55°C后 ，在通风柜中混合并轻微摇晃，不 要产生气泡。倒入大的制胶板中至所需厚度。 3. RN A样品缓冲液： IXM OPS缓冲液， 2 . 2 mol/L 甲醛， 5 0 % ( V/V) 甲酰胺。 4. R N A 上样缓冲液6X 储液 ： IXM OPS缓冲液， 5 0 % (W ) 甲酰胺， 4 0 % (V/ V O 甘油。加人少许溴酸蓝和二甲苯青作为指示剂。

3 mRNA 提取

（1）Oligotexpoly (A )+ mRNA 提 取 试 剂 盒（Qiagen)。注意：下面列出的 3 种缓冲液是试剂盒配套试剂。 ,

（2）Oligotex 结 合 缓 冲 液（OBB): 20 mmol/L Tris-HCl， pH 7.5， lm ol/L NaCl,2 mmol/L E D T A , 0 . 2 % (W V ) 十 二 烷 基 磺 酸 钠（SDS; Sigma-Aldrich)。

（3）Oligotex 清 洗 缓 冲 液（OWB): 10 mmol,/L Tris-HCl, pH 7. 5， 150 mmol/LNaCl， I mmol/L EDTA。

（4）Oligotex 洗 脱 缓 冲 液（ OEB) : 5 mmol/L Tris-HCl， pH 7. 5。

4 cDNA 探针合成

（1）1μg mRNA 样本。

（2）聚 合 酶 链 反 应（ PCR) 仪 [ 例 如 Bio——Rad iCycler (Bio-Rad)， PTC-100 (MJ Research)]
3. Olig〇-5’-dT20N-3’ （ Bio S& T ， Montreal， QC)〇 4•随机引物[100 mmol/Ld (N)6; New England Biolabs]0 5. CDS 引 物 混 合 液 （ Clontech)。 6. [a~32P] dATP (3000 Ci/mol； GE Healthcare) 〇 7. dNTP 混合液 I (dCTP/dTTP/dGTP; 各 2 . 5 mmol/L)。 8. 20 mmol/L dNTP 混合液 2 (dATP, dGTP， dTTP 各 6. 67 mmol/L)。 9. 2 mmol/L dCTP〇 10. Cy3-dCTP, Cy5-dCTP (GEHealthcare)0 11•二硫苏糖醇（ DTT) (Sigma-Aldrich)。用无菌双蒸水配制0.1 mol/L 储液 。 12. Superscript n RNase H 反 转 录 酶 （200 U/pL) (Invitrogen)。 13. RNasin (20 U /yL; Promega)。 14. 0 •5 mol/L EDTA (Sigma-Aldrich) 〇 15. 10 mol/X NaOH (Sigma-Aldrich) 〇 16. 5 mol/L 乙 酸 （ Sigma-Aldrich)。 17•异丙 醇 （ Fisher Scientific)。 18. 7 0 % 乙醇。用 5. 1 中提到的方法制备。 19. TE 缓冲液： 10 mmol/L Tris 碱 ， pH 8. 0 ， I mmol/L EDTA。

5 DNA 阵列杂交和清洗

（1）Church 缓冲液： 0.25 mol/L Na2 HPO4, 0.25 mol/L NaH2PO4, pH 7. 5 ， 7 %SDS (W/V)

（2）20XSSC: 3. 0 mol/L NaCl， 0•3 mol/L 梓 釋 酸 钠（Sigma-Aldrich)。

（3）2 0 % SDS (W / V )

（4） 酵母 tRNA (10 mg/mL) (Invitrogen)。

（5） 小牛胸腺 DNA (10 mg/mL) (Sigma)。

（6）DIG Easy Hybe 溶 液（Roche)。

6 DNA 阵列分析

（1）X 光底片或磷屏成像系统（ 用 于 ATLASTMcDNA 阵列）。

（2） 微 阵 列 分 析 仪（ 分析人的 19K cD N A 阵列）。有很多公司 ( AlphaInn 〇 tech、 Affymetrix、 VersArrayChipReader) 销售阵列分析仪，但有些公司或服务机构(还有很多研究所的设备中心）能够提供收费的阵列扫描和分析服务，这样比购买一台分析仪要经济得多。

3 . 可以下载的分析软件（ 例如 Scanalyze; http://rana.lbl.gov)。

7 结果验证：半定量反转录酶_聚合酶链反应（RT-PCR)

（1）DNAman 软 件（Lynnon Biosoft)。

（2）引 物 设 计 软 件（Scientific and Educational Software)。

（3）BicrRadiCycler (Bio^Rad) 或其他梯度 PCR 仪 。

（4）50XTAE 缓冲液： 242 g Tris 碱 ， pH 8. 5, 57. Im L 冰乙酸， 37.2 gEDTA ， IL 双蒸水。

（5）1 % T A E 琼脂糖凝胶： I X T A E 缓冲液， 1 % 琼 脂 糖（ W/V） , 溴 化 乙 锭（1 μg /mL) 加入到 100 mL 水中。

（6）DNA 上样染料： 0.25% (W/V） 溴酚蓝， 0.25% (W/V ) 二甲苯青， 5 0%(W /V ) 甘油。

（7）DNA 分子质量标准（Invitrogen)。根据预期的 PCR 产物大小选择合适的分子质 量 标 准（从 100 bp 到几 kb 不等)。

二、方法

在开始任何微阵列实验之前，必须要选定合适的对照和时间点，这样获得的数据才有生物学意义。关于如何选择合适的对照，参见注释 1 和 2。

1 总 R N A 的提取

1. Poly (A ) + mRNA提取试剂盒可用于冰冻组织样品中poly (A )+HiRNA的富 集 ；但是经验告诉我们采用试剂盒进行一步法提取时得率一般较低。我们建议 采用传统的总RNA提取方法，并 对 RNA进行检测以保证较好的质量，然后进 行 mRNA的提取和阵列的杂交。 2. 对照和实验样品在TRIzol中 匀 浆 （ 每 100 m g冰冻组织加入I mL TRIzol)，迅 速加入氯仿（ 每 I mL TRIzoI 中加入0. 2 mL)。反复快速颠倒混匀15 s 后于室 温孵育5 min。 4°C下以最高速离心10 min。 3. 将上层液体转移到一个无菌的无RNase的 Eppendorf管中，加人等体积异丙醇 沉 淀 RNA。于室温孵育10 min。 4. 4°C下最高速离心10 min沉 淀 RNA。将上清小心弃去，用 7 0 % 乙 醇 （250 pL) 清洗沉淀，最高速再次离心5 min。倒掉乙醇，让沉淀晾干。小心不要使沉淀过 分干燥，这可能会给重溶带来一定的困难。以大约每10 jug沉淀加人10 fxL水 的 比 例 将 R N A 溶 于 DEPC水，一20°C保 存 （ 如果可以于一周内使用）或 —80°C (长期保存）保存。 5•利用分光光度计通过测定260 nm和 280 nm的吸光值检测R N A的浓度和纯度。 纯度较好的RNA A26。： A28。的值应介于1. 6 和 2. 0 之间。再进一步通过RNA 凝胶电泳检测R N A的质量。根据4 0 畔 RNA A26。为 1. 0 0 的标准，计 算 10〜20 砘 总 R N A的量。

2 R N A 变性凝胶电泳

（1）制备一块 1 % 的琼脂糖甲醛变性胶，浸没在 IXM OPS 缓冲液中，胶上的孔应被溶液完全没过。将胶预电泳 15 min (与此同时准备 RNA 样品）。

（2）取适当体积的总 RNA (含 有 10〜2 0 μg RNA)，加人到置于冰上的标记管中，用 DEPC 水调整总体积到 15 μL。向每管中加入 15 μLRNA 样品缓冲液和 6 μL6X RNA 上样缓冲液。

（3）将样品于 55°C 孵 育 10 min, 迅速置于冰上。向每管中加入适当体积的 R N A 上样缓冲液，使每个样品中的上样缓冲液达到 I X 的终浓度。

（4）将 RNA 样品轻轻混匀，短暂离心，将所有的样品都收于 Eppendorf 管的底部。

（5）将每个管中所有的样品都加到胶孔中，记录加样顺序。

（6）于 100 V 进行电泳，当指示染料的前端到达胶底部时结束电泳。胶置于塑料膜上，于紫外灯下观察 电 泳 结果。 28S 和 18S 核 糖 体 RNA (rRNA) 条带作为RNA 质量的判断标准，两者比例应该约为 2 : 1 。 这一步保证了 D N A 阵列杂交用 mRNA 提取之前的总 R N A 的质量。虽 然 总 R N A 也可用来进行探针合成，但是我们推荐使用 mRNA。 当 28S rRNA 与 18S rRNA 条带的比例远不足 2 : 1或样品条带出现弥散时，可 认 为 R N A 的 质 量 比 较 差（关于微阵列分析所用R N A 的最大量见注释 3)。

3 用 Oligotex mini Kit (Qiagen) 进行 mRNA 提取

1. 在水浴中将Oligotex悬液加热到37°C ，振荡混匀后置于室温。 2. 将金属恒温仪设置成70°C ，将 OEB置入加热。 3. 取 0.25〜0.5 mg高质量的总R N A开始实验。后面实验中如果mRNA产量不 够 ，可能要对特定组织或动物的总RN A量进行调整。 4 . 将 总 R N A 吸人一个无RNase的 I.5 mL Eppendorf管中，用 无 RNase的水调整 体 积 至 500 jiL。 5•加人 500 /nL OBB 和 30 fxL Oligotex 悬液。 6. 将样品在70°C 的金属恒温仪中孵育3 min以破坏二级结构。 7. 将样品从恒温仪中取出后置于室温1〇 min, 让 Oligotex悬液中颗粒上的oligodT3。与 mRNA的 poly (A ) + 进行结合。 8 . 最大转速离心2 min沉淀Oligotex-mRNA复合物，小心吸去上清。 9•加人400 OWB吹打重悬Oligotex-mRNA复合物，将悬液吸到一个离心柱 (试剂盒提供）中，将柱子置于一个无RNase的 I.5 mL Eppendorf管中，最大 转速离心I min。 10.将离心柱转移到一个新的I.5 mL Eppendorf管中，向离心柱中加入4 0 0 卟 OWB, 最大转速离心，弃去滤液。 11•将离心柱转移到一个新的I.5 mL Eppendorf管中，向离心柱中加人20 ^ xL热 的 （70°C ) 0 EB，吹 打 3 〜4 次 重 悬 Oligotex-mRNA，最大转速离心 I min， 收集含有纯化的mRNA的洗脱液。 12•重复步骤1 1 以得到最大产量的mRNA，将两次洗脱液合并（ 进一步的mRNA 处理是不可取的，见注释4)

4 cDNA 探针合成

（1）PCR 仪 预 热 到 70°C ，向 每 个 0. 5 m L 的 PCR 管（或 0 •2 m L 的管子，取决于PCR 仪加热模块上孔的大小）中加入 Iμg (至少 0.5 ( ug/μL) 的各个 mRNA 样品（ 对照或实验组）。向每管中加人 100 ng 01igo-5’-dT20N-3’ 和 100 n g 随机引物（共 200 ng)，确保整个 mRNA 库的完全标记。
2. Clontech ATLAS™ 试剂盒推荐使用Ijx L 附带的CDS引物混合液，这种混合液 中包括了阵列上所有基因的序列特异的引物。虽 然 CDS引物混合液用于冬眠动 物物种的mRNA样品效果相对较好，我们发现将CDS引物换成100 ng Olig0- 5'-d T 2QN-3'和 IOOng随机引 物 （ 共 200 ng) , 高丰度的基因能得到差不多的结 果，结果对样品中的所有基因也具有更好的代表性。这是由于CDS混合引物含 有物种特异的引物，对那些与CDS引物序列覆盖区域差异较大的基因来说，结 合度较差。因此在进行系统进化树上距离较远的非哺乳动物的筛选实验时，使 用 01ig〇-5^d T2flN-3<是绝对有必要的。 3•加入必要体积的DEPC 7jC将反应总体积调整到3 ( uL，置 于 PCR仪 上 孵 育 2 min 后 ，将温度降低到50°C再 孵 育 2 min, 使引物与mRNA进行充分杂交。 4•制备Clontech ATLAS™ 阵列所用的ATLAS™ 反应混合液，向每个〇.5 mL Eppendorf 管中加入： 2 juL 5X 反 应 缓 冲 液 （ 包括 Superscript n ， Invitrogen)， 1 pL dNTP 混合液 I (dTTP、 dCTP 和 dGTP 各 2. 5 mmol/L ， Invitrogen)， 0. 5 fxL 100 mmol/L DTT 和 3. 5 JiiL [CT32P] dATP (3000Ci’mol; GE Healthcare)。 也可以用其他放射标记的核苷酸，只要它不包括在dNTP混 合 液 中 （ 例如可以 用 [C 1 -32P] dGTP和由dATP、 dTTP和 dCTP组 成 的 dNTP混合液） 。制备荧 光标记的cDNA反应混合液（ 使用荧光标记的dNTP的注意事项见注释5)，每 个反应应包括： 8 | ^ 5 乂 反 应 缓 冲 液 ， 3 / ^ 2 0 _ 〇 1 / 1 £ ^丁 ？混 合 液 2 (dATP、 dCTP 和 dTTP 各 6. 67 mmol/L ), I pL 2 mmol/L dCTP, I pL 1 mmol/L Cy3 或 Cy5 dCTP (用一种标记对照组，另一种标记实验组)， 4 pL 0• I mol/L D T T 和 2 0 斗 水 ，将反应体积调整到3 7 斗 。将反应液置于冰上。 5 . 向反应混合液中加人Superscript Il反转录酶，完成反应体系制备。 ATLAS™ 阵列试剂盒包括一支M M LV反转录酶，但是我们发现这种酶的活性比较低。 因此我们推荐将每个反应中的I fxL MMLV换 成 I pL Superscript II反转录酶。 同时我们建议每个反应中加人I /iL RNase抑 制 剂 （ Promega)_防止R N A降解。 吹打混勻。 6. mRNA于 50°C孵 育 2 min后，向每个反应中加人8 ATLAS™ 反应混合液合 成放射标记的cDNA或加人37 荧光反应混合液合成荧光标记的cDNA，于 42°C孵育。对于放射标记探针，孵育时间应不低于25 min。对于荧光标记探针， 由于碳菁染料较难插入，反应时间要明显延长（ 至 少 2〜3 h)。加 入 IfxL 0.5 mol/L EDTA终止反应。终止后的反应液可保存在一20°C过夜。 7•探针的纯化方式取决于是荧光标记还是放射标记。放射标记的探针用Clontech ATLAS™ 试剂盒里附带的离心柱纯化，去除体系中剩余的核苷酸。然后每个单 独制备的放射标记的探针与它们各自对应的阵列进行杂交。荧光探针的纯化首 先进行RN A水解：加 人 2 juL 10 mol,L NaOH于 65°C孵 育 20 min后 ，加 入 4 5 mol/L 乙酸中和反应。加 入 100 FL 异丙醇，冰上放置30 min，离心将标 记 的 cDNA沉淀下来，用 7 0 % 乙醇清洗沉淀。 Cy3 和 Cy5 标记的cDNA样品晾

干后，各自溶解于 5 / μL 水或 TE (10 mmol/L Tris 减 ， pH 8.0 ，I mmol/L EDT A ) 缓冲液中，这两个样品在与阵列杂交前混合成一个 cDNA 库 。

5 DNA 阵列杂交和清洗

5.1 Clontech ATLAS™ 阵 列 的 杂 交 和 清 洗（见 注 释 6)

（1）阵列的同源杂交建议杂交温度为 68°C ，但是我们发现异源杂交温度必须要低一些。对哺乳类冬眠动物来说， 68°C 杂交也能产生信号但是 55°C 杂交效果会更好。我们最终发现 44°C 在 Church’s 缓冲液中杂交过夜结果最好。与非哺乳类物种进行异源杂交时，将温度降低到 40°C 会产生最好的杂交信号，背景也极低。

（2）杂交结束后，需要通过调整和监测清洗步骤保证异源杂交系统中没有杂交信号损失。清洗开始用 5 X SSC (用 20 X 的储液稀释）， 1 % SDS, 然后用 2 XSSC,1 % SDS, 再用 1XSSC, 0. 5 % SDS，最后用 0 •5XSSC， 0 •5 % SDS。每一步清洗完后， ATLAS™ 阵列都需要用盖革计数器检测杂交信号强度。如果发现信号降到 500〜1000 cpm，应立即停止清洗，将 ATLAS™ 阵列用 X 光片或射线显影板曝光。当底片显影或显影板扫描读取后，可将两张底片或两张图像（对照和实验组）叠放，首先进行目测筛选差异表达基因。如果要得到更加量化的结果，将来自显影板或 X 光片的每张图像转化成软件可以分析的.tiff 文件。

（3）ATLAS™ 阵列至少可以重复使用 3 次。阵 列 在 10% SD S 中 煮 10 min 进行洗脱 ，然后用 2 X S S C 去 除 SDS。将阵列用玻璃纸包裹后保存于-20°C 至再次使用。

5.2 人 19K 微 阵 列 的 杂 交 和 清 洗（采 用 Ontario 癌症研究所的实验方法，www.microarray,ca/ , 见注释 6)

（1）制备杂交液。每个杂交反应取 100μL DIG Easy Hyb 溶液，加 入 5μL 酵 母 tRNA (10 mg/mL) (Invitrogen) 和 5 μL 小牛胸腺 DNA (10 mg/mL) (Sgma)减少非特异结合。混合物于 65°C 加 热 2 min，冷却到室温。

（2）向 Cy3-Cy5 标 记 的 cDNA 样 品 中 加 入 80 μL 制备好的杂交液，混合物再置于65°C 加 热 2 min，冷却到室温。

（3）使 用 1 9 K 人源微阵列时，由于基因点在两块玻片上，所以向玻片上加入制备好的探针时应非常小心。将一张玻片放在另一张上，两张玻片都将点有阵列的一面向内。小心将含有探针混合物的杂交液缓慢均匀地沿着其中的一边加入以防止产生气泡。

（4） 将剩余的杂交液置于一杂交盒（水平放置于 37°C 恒温箱中的可密封的玻片盒）中用来保证杂交反应体系的湿度。将玻片置于杂交盒中 37°C 孵育过夜。不需要调整杂交温度。

（5） 杂交结束后，用 2XSSC 洗去玻片上的杂交液，将微阵列玻片置于一个玻片架上进行进一步清洗，先用预热的（50℃） 2XSCC， 0.1 % SDS 洗 1 0 min，再用预热 的（50°C) 1XSSC， 0.1% SDS 洗 10 min。最后，将玻片浸人 I X S S C 中，然后用异丙醇短暂清洗， 500 g 离心去掉未结合的荧光cDNA 。微阵列可以用两个波长扫描，对不同的荧光定量。生成两个图像文件后进行荧光强度分析。如果担心由于进化上较大的差异不能产生好的杂交信号，建议清洗时降低严谨度。例如当研究中使用的 cDNA 同源性只有 6 0 % 〜8 0 % 时，建议将清洗温度降低到45°C , 而且只进行 2X SSC 这一步清洗。根据我们和其他实验室的经验（40)，洗液中的盐浓度对于去除阵列上结合的探针最为关键。

6 DNA 阵列分析

cDNA 阵列的分析近年来已经变得越来越简单。我们的分析主要是用 Michael Eisen 开发的 Scanalyze 程序完成的，这 个 程 （http://rana.lbl.gov/) 是免费的，可以与阵列上目标基因的目测筛选搭配使用。 Scanalyze 允许用户一次输入两个阵列图像， 一般来说一张为 Cy3 杂交生成的扫描图像，另一张为 Cy5 生成的图像。可以从 http://rana.lbl.gov/manuals/ScanAlyzeDoc.pdf 获得进一步的信息。还有很多其他的 DN A 阵列分析软件，相关内容见注释 7。

（1）将 19K cDNA 阵列 Cy3 和 Cy5 扫描保存的.tiff 文件分别在 Channel 1 和 Channel2 中打开。

（2）图像载人后，点 击 「redraw」调整每张图像的增益和均一化使它们具有相同的亮度和强度。

（3）对图像挪格化将每个 19K cDNA 「点」都用一个 Scanalyze 生成的圆圈框起来。对每一批新导入的阵列图像都要先创建新的栅格。在 Grid Control 面板上点击「New Grid」，选 取 1〜32 个格子。

（4）输人每个格子的行数和列数、行宽和列宽，以及行高和列高。

（5）由于阵列点印有时做不到很理想，格子可能与阵列不太匹配。如果出现这样的情况，可以用 Scanalyze 的 方 向 按 钮（directional) 将格子进行上下左右移动和拉伸。当阵列的格子调整到差不多在每张图像上能够重合时，按 「refine」,Scanalyze 会将格子调整到最合适的大小。如果选定的点出现错配，可以通过「spot」选项和方向按钮的操作对这些点进行单独匹配。

（6）当格子调整到适合阵列后，点击数据保存按钮（save data)。 Scanalyze 会对阵列上每个点的输出信息进行计算，结果 以 tab 分页格式导出，可 在 Microsoft Excel 中 打开。

（7） 目前为止最快速、最简便的分析方法仍是测定 Channel I : Channel 2 生成的杂交信号强度的比值（例如对照组与冬眠组）。通过这种分析可以得到两种状态下基因水平比较的一个概况。由于数据导出到 Microsoft Excel 中，可以对比值从高 到 低（或从低到高）进 行 排 序（点 击 「Data」，然 后 选 择 「Sort」）。显示出阵列中上调或下调最明显的点，鉴定其对应基因后，进行后续分析（见注释 8)。

7 结果验证：半定量 PCR (见注解 9)

（1）对每个筛选出来的目标基因，从 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) 下载其他动物中的同源基因序列。

（2）从下拉菜单中选择「nucleotide」，输人目标基因的名字或缩写。

（3）得到一个基因的序列后，可以很简单地利用 Blast 数 据 库（www.ncbi.nlmnih.gov/BLAST/ ) 搜索获取其他物种同源基因。下载目标基因在多个物种中的同源序列。例如研究松鼠基因时，可以选择其他啮齿类和（或）哺 乳 动 物（例如小鼠、大鼠和人) ‘ 的序列。例如对于冬眠动物的基因，我 们 一 般 用 人（Homo小 家 鼠（MmswzmscmZ ms) 和 褐 家 鼠（兄 确 定 同 源 区域。对进化距离更远的动物来说，选择更具多样性的基因和（或）来自与目标物种系统发育上更接近物种的基因会更加有效。例如分析一个海龟的基因时，选择蛙类、鸡和大鼠的序列进行初始分析会更合适。 一 般 选 择 3 个同源序列就足够，但是要对一个基因进行更深人的研究，可以选择多个序列进行分析。4•将每个序列（ f f . 扣eras、 M.wmscmZ ms 和jR.woroeg^cM 5) 在 DNAman 中打开。 选 择 “Edit”，在下拉菜单中选择“All”，将每个序列对应输入（ Sequence, load channel)。序 列 载 入 后 ，选择 “ Sequence, Multiple Alignment, Add From Channel”，导入所有的序列。选 择 “fullalignment”，点 击 “OK”。软件会显示 一个全面的基因联配结果，同源区域用暗色阴影标出。 5•找到同源性较高的区域后，用 Primer Designer软 件 （ ScientificandEducational Software) 设计引物序列。 3'端 10个碱基中没有错配的引物序列可用来进行引 物合成。当序列的变异度较高时，设计兼并引物从生物个体中扩增cDNA序列。 然后用得到的这个cDNA序列设计物种特异的引物，进行表达分析。物种特异 的引物也可用于cDNA末端快速扩增技术，从而获得目标基因完整的可读框序 列 （12)。 6. 合 成 cDNA第一链的方法除了不加入标记的核苷酸外与D N A阵列探针合成部 分 相 同 （ 见3.4;参见注释10)。反应混合液包括21 ^^5\反 应 缓 冲 液 （11^^〇- gen)， 0. 5 juL 100 mmol/L DTT 和 I fiL 10 mmol/L dNTPs (dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP 各 2. 5 mmol/L)。 7. 对于一个未研究过的物种的新序列，为了优化PCR条件，我们常规在一台梯度 PCR仪上设定一个50〜70°C 的温度梯度。加热模块一般设置为进行8 个样品的 温度梯度PCR反应，这样每个样品间的温度增值为2. 5°C 。冰上制备反应混合 液，每个反应50 juL, 包 括 5 10X 反应混合液， 2. 5 (nL 50 mmol/L MgCl2, I pL 10 mmol/L dNTPs， I fxL 0 •5 ymoi/L PCR 引物， I 模板， 0. 25 fJL Tczg DNA 聚 合 酶 （ Invitrogen) 和 39. 25 水。 8 . 常规的PCR反应步骤为起始于95°C变性2 min, 然后进行35个循环反应，包括 95°C 45s，复 性 （50〜70°C 4 5 s) 和 72°C 延伸。 72°C 延伸时间取决于扩增产物 的大小。 T ag聚合酶具有较高的活性，所 以 Imin足够进行I k b 的 DNA扩增， 对于短片段的扩增可以将时间再缩短些。 35个循环结束后，最后再于72°C延伸 10 min, 将 PCR反应设置在4°C恒温或将样品取出置于4°C冰箱。 9. 将所有的PCR反应产物进行1 % T A E 琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染胶，紫外 灯下观察并拍照记录电泳结果。选取产生最大扩增的复性温度[和（ 或）延伸 时间用作后续实验的反应条件]。
10.对 PCR产物进行测序验证是否的确为目标基因。 11•当复性条件选定， PCR产物也验证确为目标基因后，可以开始进行对照组和实 验组比较。将对照组和实验组的样品的第一链cDNA梯 度 稀 释 （ 例 如 ItT1、 1(T 2、 1(T 3、 1(T 4)。对照基因也进行同样比例的系列稀释，用于扩增反应。 像^1113111111， （3-actm或甘油酸-3-癖 酸 脱 氢 酶 （ 商业网站上一般称之为GAPDH) 等基因的商品化引物可以应用于序列高度保守的物种。但对于那些进化 上距离较远的物种，建议针对管家基因同源性较高的区域自己设计引物。 12.用每个稀释浓度的对照组和实验组样品作模板进行PCR扩增。反应结束后， 产物进行1 % T A E 琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染胶，紫外灯下观察结果。用 图像分析软件（ Imagequant) 测定每个泳道条带的亮度。很可能会有一个或多 个较低稀释倍数的反应的对应条带出现亮度饱和，所以选择不完全饱和但具有 足够强度的条带进行定量。这一步是为了保证用来定量的条带亮度落在所用图 像分析软件的线性范围内。每个泳道中目标基因的条带亮度可以与对应管家基 因的亮度进行校准，从而消除有可能由上样量不均引起的误差。

8 展望一 微阵列数据的可比性，比较基因组学和冬眠

对于 DN A 阵列分析，早期人们比较担心的是缺少能够收纳研究产生的大量信息的公 共 领 域（48-50)。解决方法是创建特别的公共数据库，研究者可以通过这种数据库的免费使用接触到大量微阵列数据，从而促进一些看上去不相关的领域的快速发展。举例来说，一个研究者在研究某一特定基因时，可以通过查询各种各样的微阵列数据来确定这个基因的时空表达情况，从而提出与其他基因相关的基因调控的假设。这正是 NIH引入的基因表达数据库（GEO) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ ) 的 目 的 （51，52)。同时还有其他的微阵列数据库，比 如 Standford 大 学 微 阵 列 数 据 库 [StandfordUniversity Microarray Database (http：/ 7 genome-www5. Stanford,edu/)], 列出了公共数据、参考文献和数据来源的物种；欧洲生物信息学研究院（EuropeanBioinformaticsInstitute) 的 ArrayExpress 数 据 库（http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) (53-56)，功能与 NIH GEO 数据库相似，包括覆盖了至少 35 个物种的超过 12 000 个杂交的数据。目前为止， GEO 是最大最全的开放数据库，提供科学家免费查询获得的高通量数据，这些数据涉及 mRNA 表达、基因组 DNA 分析、基因表达系列分析（SAGE)、质谱和蛋白质组学等方面。虽然这些数据库非常有用，特别是对于模式生物的研究者，但是它们最近才开始被从事比较学研究的人所使用。
很明显通过跨物种的异源微阵列分析，比较研究学家能够极大地提高他们的研究产出。下列两种情况不能采用跨物种的异源阵列筛选方法： （1 ) 阵列和目标物种基因之间的同源性太低； （2 ) 对某一特定物种特异的新发现的基因，从而在商品化的阵列上没有对应同源物。但越来越多的新物种阵列正在不停地产生，所以某种程度上来说，当与目标物种系统发育上接近的物种有可用的阵列时，上述两个问题都能被克服。例如在冬眠研 究 领 域 ， Matt A n d rew s 实 验 室 （5 7 ) 最 • 近 用 来 自 于 墨 西 哥 黄 鼠(S.irzWecemGweatos) cDNA 文库中的 4000 多 个 cDNA 制备了一’个 DN A 阵列，并用这个阵列进行冬眠期间心脏内转录组的分析。由于阵列上只点了 4000 个基因，基因组的很大一部分未列在其中，因此目前来说，异源杂交得到的结果更具有广泛性，比如我们
地松鼠的 cDNA 和商品化的人 19 OOO 个基因的阵列杂交，杂交度达到 8 5 % 〜9 0 % 。但是，用物种特异的阵列有机会发现只存在于冬眠动物中的新基因（即人类的基因组中没有的基因），因此物种特异的阵列在冬眠表型的遗传分析中有着不可取代的作用。
由于不管使用何种阵列平台，阵列筛选之后必然进行的是严格的后续分析，所以这对使用异源 cDNA阵列杂交的比较生物学家来说是一个优势，特别是在目标物种与模式物种有较高同源性的情况下。由于全世界的生物学工作者都在对非传统模式物种的基因组进行测序，包括人类基因组计划指定要进行全基因组测序的墨西哥黄鼠，异源微阵列分析领域在未来几年中必将有很大的发展。对多物种的基因和基因结构的注释和分析将为精确的基因鉴定和同源性分析提供可能，并且进一步确认异源微阵列对未来比较生物学家的跨物种工作的重要价值。

注意事项

（1）任何阵列研究很重要的部分是确定实验路线和合适的对照。在所有的科学工作中，选择合适的对照条件是恰当诠释处理条件下基因表达变化的关键因素。这点 在阵列筛选研究中看上去尤其重要，因为这种研究进行的是 mRNA 的分析，而 mRNA 在细胞中半衰期极短，所以对阵列研究来说最好能选择在时间和处理前状态上尽可能相似的对照和实验组样品，目前冬眠研究领域的一个现有的争论提供了很好的例 子。我们想要了解蛰伏的调控机制以及什么基因的表达需要被上调从而帮助动物进人蛰伏状态和（或）稳定代谢，活过这个很长的蛰伏期^因此我们选择了尽可能相 似的对照和实验组动物：在这个实验中，对照组是体温 37°C 的动物，它们在一个 5°C 的房间里但还没进人冬眠，而实验组动物是在同一个房间内已进入蛰伏期的动物，它们的体温已接近室温。这样我们就可以得到活跃状态和蛰伏状态基因表达的差 异。与此相反，一 些其他的研究小组提倡用夏季活跃的动物与冬天进入费伏期的动物进行比较 （58)。这样做可以体现器官中 mRNA 的季节差异但对于冬眠调控的研究来说是不合适的，因为夏季和冬季的动物存在太多差异，包 括 环 境 条 件（例如光周期和温周期）、生理状态(例如进食活跃与否， •夏季动物地上频繁活动对比冬季蛰伏动物在洞穴中进行睡眠），以及生殖状态。这种差异使得我们不可能「切割，，出蛰伏特异的基因表达变化来单独研究。因此 夏季活跃的动物可以说是一个极为糟糕的生物学对照，更可以说是一个错误的时间点，对冬眠的整体研究是一个毁灭性的因素。事实上，应用我们的实验体系（恒温 的相对于蛰伏的动物）进行基因筛选，结果显示当动物进人蜜伏期后有大量基因的表达被特异性地诱导；这些基因看上去在蛰伏状态下发挥着不可或缺的生物学功 能。相对于恒温的对照组，我们也在蛰伏实验组中发现了应激诱导的信号转导途径发生了广泛的器官特异性的激活，
其中包括了丝裂原激活蛋白激酶 （17, 59)，说明蛰伏期间体内器官还是维持了基本的代谢活性。这些发现实际上与一些之前冬眠研究中所谓的「常规的经验」相反，它们认为蛰伏期间大多数的生物进程都减弱或干脆停止。

（2）值得注意的是我们用 Kinexus Kinetworks™ 磷酸化蛋白（表 2 ) 进行的应激标记物筛选，结果显示了选定的蛋白质在冬眠期的墨西哥黄鼠肝脏中磷酸化状态有所改变，对冬眠动物在蛰伏期体内确实维持了一定的代谢活性这个概念 是一个有力的支持。结 果 显 示 p3 8 (Thr18°/Tyr182) 磷酸化状态没有改变， JUN(Ser73) 磷酸化程度的提高， A K T 在 Ser473 而不是 Thr3。8 位置上磷酸化程度的降低。我们的数据与之前对贝氏黄鼠（S.H ckr 心 和 墨 西 哥 黄 鼠 的 研 究 结 果一致：蛰伏期间， P3 8 活性不发生变化，而磷酸化 JU N 的上游激酶 JN K 的活性则被大幅度提高 （5 9 ) ; 而之前对墨西哥黄鼠的研究也显示在蛰伏和冬眠期间 A K T 在 Ser473 而不是 Thria8 位置上磷酸化程度的降低 （60）。因此阵列筛选的数据与很多传统实验体系得到的数据是相吻合的。


（3）微阵列分析所用的 cDNA 探针要进行荧光或放射标记。荧光探针专用于高密度的 DNA 微阵列,32P 标记的探针一般用于宏阵列，像 Clontech ATLAS™ 阵列。异源杂交实验中，根据我们的经验当满足以下几个条件时，实验会很成功：
a. 两个物种间基因的同源性较高（检测物种相对于制备阵列的物种）。

b. 最适量的初始材料。

C. 比同源杂交实验的严谨度稍低的杂交条件。


的，通常只需要注册并在文章中引用即可。其他一些程序需要研究者购买授权 许可，但并不一定比大量的免费程序做得更好8 . 多数情况下1. 5 倍的基因表达差异看上去已经足够体现对照组和实验组的统计 学显著差异，但可能还是会失去一些重要的实验线索。可以用另一层次的分析 方法评估一组相关的基因在应激响应的信号途径中的总体改变。例如， Mootha 等 （5 3 ) 的研究发现，在对分成3 组 （ 正常糖耐量、糖耐量障碍和糖尿病患者） 的适龄成年男子骨骼肌中的22 000个基因进行分析时，根据前一种统计学分析 标准，没有任何差异表达基因，简单来说就是在单基因分析基础上几乎检测不 到这3 组之间基因表达的差异。但是通过将这些基因分组进行基于信号途径的 分析时，他们发现氧化磷酸化相关的基因在糖尿病患者中出现协同性的下调， 通过这条线索发现了转录因子PGC-U 在糖尿病患 者 中 表 达 下 调 了 约 2 0 % (63)。这种根据已知的信号途径将基因分到几个指定组中分析的Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) 方法在与一特定应激相关的生化功能鉴定方面有很 大的帮助。当然这种分析需要先对信号途径及它们对下游基因表达的效应有一 定的了解，这些要求在比较生物学中不一定能得到满足。 9 . 虽然后续的微阵列分析一般采用定量RT-PCR (Q-PCR)， 事实上我们觉得比较 学研究中对微阵列筛选获得的数据进行Q-PCR分析没有必要。这是因为我们研 究的主要目标是发现对照组和实验组之间基因表达的相对改变（ 比如一个基因 的上调或下调） ，而不是每个样品中每个mRNA转录物类型的量变。所 以半定 量 RT-PCR就已经足够了。而且所谓 的 “定量” P C R 的概念不仅不准确而且具 有误导性。要得到一个确切定量的结果，必须在分析的每一步都要有对照，包 括从RNA 提取的百分得率到将已知质量和数量的对照mRNA加入提取的RNA 中，这样下游分析就可以得到一个精确的标准。异源筛选的基因表达差异验证 一般采用Northern印 迹 （ 包括点印迹或狭缝印迹）或半定量RT— PCR两种方 法。当差异表达的目标基因已经被克隆而且研究者能拿到克隆时， Northern印 迹或点印迹会是更好的下游分析方法。但是多数情况下，比较生物学家会选择 半定量RT-PCR， 这种方法较为有效是因为： （ a) PCR 有利于基因表达的高通量分析； （ b) 同时PCR产物可作为部分序列分析的材料，研究者对这部分序列 翻译后可以评估氨基酸序列的改变并通过在Genbank中与同源物的比较检测到 目标物种蛋白可能的结构或功能差异。 10•使用RT-PCR进行验证时，很重要的一点是要对尽可能多的总转录物进行扩 增。 01igo-5'-dT^ N-3'引物可用于很多片段较小的mRNA ( < 2 kb) , 但是片段 较大的mRNA由于含有二级结构，所以要加入其他引物。因此最好在第一链 cDNA合成时在体系中也加人随机引物。



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